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草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是分布十分广泛的重要经济作物之一,被认为是研究非跃变型果实成熟的模式植物,尽管已经做了大量的研究工作,但非跃变型果实成熟机理仍有待深入探讨。本文以丰香草莓(Fragaria×ananassa Duch.cv.Toyonoka)为试材,从生长素和脱落酸及其相关基因表达与草莓果实的生长、发育、成熟的关系入手,在克隆草莓果实Aux/IAA及ASR基因并制备其抗体的基础上,探讨了果实发育进程及外源NAA与ABA对果实两个基因表达及蛋白表达的影响,并构建了pCanG-FaAux/IAA1、pCanG-FaAux/IAA2和pCanG-FaASR表达载体。研究结果加深了人们对生长素与脱落酸影响草莓果实生长、发育、成熟的作用机制的了解,具有一定的理论及现实意义。主要研究结果如下:
1.采用RT-PCR法并和Race法相结合,克隆到了3个Aux/IAA基因和一个ASR基因,分别命名为FaAux/IAA1、FaAux/IAA2、FaAux/IAA3和FaASR,并且获得了四个基因的全长序列。
2.采用Northern杂交研究了上述基因在草莓果实发育进程及不同组织器官中的表达模式。结果表明FaAux/IAA1、FaAux/IAA2和FaASR在草莓各个器官中都有表达,不具有组织特异性,而FaAux/IAA3不表达。其中FaAux/IAA1、FaAux/IAA2与草莓果实早期(即小绿期和大绿期)发育过程关系密切,且与草莓成熟有一定关系;而FaASR与草莓果实成熟密切相关,随着果实的发育成熟其表达逐渐增强。
3.采用Northern杂交研究了外源NAA和ABA处理对大绿及白熟期草莓果实FaAux/IAA1、FaAux/IAA2和FaASR基因的表达调控。外源NAA处理明显促进大绿及白熟期草莓果实FaAux/IAA1和FaAux/IAA2基因的积累,而且外源NAA在大绿期处理对两个基因表达产物的积累效果优于白熟期。表明生长素对Aux/IAAs基因表达的调控与草莓果实的发育进程密切相关。外源ABA处理能有效促进大绿、白熟两个时期草莓果实中的FaAux/IAA2基因的表达,但ABA对FaAux/IAA1的诱导作用在处理后期尤其进入成熟后期并不明显,表明FaAux/IAA1与草莓果实成熟关系更为密切,能够抑制草莓果实的成熟。
外源NAA处理能有效抑制草莓果实.FaASR基因表达,且该作用与草莓成熟度密切相关,大绿期时的抑制效果在处理后4 d以后才逐渐表现,而白熟期则主要表现为处理后48 h以内的短期抑制作用。外源ABA处理能迅速诱导两个不同时期草莓果实的FaASR基因的表达,在30 min内即能表现较强的作用效果,充分证明ABA促进草莓果实成熟的作用与FaASR的积累密切相关。
4.FaAux/IAA1和FaASR原核蛋白表达及多克隆抗体制备。分别将FaAux/IAA1和FaASR基因克隆到原核表达载体pET-3c上,构建了重组原核表达载体pET-FaAux/IAA1和pET-FaASR。将构建好的两个载体分别转化到大肠杆菌BL21中诱导表达菌体蛋白,实现了His-FaAux/IAA1和His-FaASR融合蛋白的高效表达。通过亲和纯化得到浓度高达0.5mg/mL的纯化蛋白。经过对新西兰兔进行5次免疫,获得了多克隆抗血清并采用免疫吸附方法对抗血清进行纯化,酶联免疫(ELISA)和蛋白质印迹(Western blotting)的分析表明:所制备的FaAux/IAA1和FaASR多克隆抗体均具有很好的效价,同时具有良好的灵敏度和特异性。
5.蛋白印迹分析草莓不同组织器官、果实发育过程以及大绿期生长素和脱落酸处理后FaAux/IAA1和FaASR蛋白的变化规律。研究表明,FaAxu/IAA1蛋白和FaASR蛋白均广泛存在于草莓的各个器官中,参与草莓生长发育的多个环节。其中,FaAxu/IAA1蛋白的表达与草莓果实发育进程呈现负相关性,即:随着草莓果实的成熟,该蛋白表达逐渐减弱;而FaASR蛋白的表达与草莓果实的成熟进程呈现正相关性。大绿期外源生长素处理能明显抑制草莓果实FaAux/IAA1蛋白的表达:而外源ABA处理则能明显促进大绿期草莓果实FaASR蛋白表达量的增加。
6.分别将.FaAux/IAA1、FaAux/IAA2和FaASR基因克隆到植物表达载体pCanG上,构建了重组植物表达载体pCanG-FaAux/IAA1、pCanG-FaAux/IAA2和pCanG-FaASR。