论文部分内容阅读
本文主要从以下几个方面进行论述 Ⅰ人源化乳腺癌耐药蛋白高表达BCRP-MDCKⅡ细胞模型的建立 乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein, BCRP）的分子量约为72 kDa，属于ABC转运蛋白超家族。BCRP通过利用ATP水解释放的能量，将细胞内的有毒物质或者药物通过胃肠道、胆汁和尿液排出体外，发挥其抵抗外来毒性物质侵袭的作用。本研究应用慢病毒感染MDCKⅡ细胞的方法建立人源化BCRP高表达BCRP-MDCKⅡ细胞模型。结果表明: 1.酶切实验和DNA测序结果表明，携带目的基因ABCG2表达质粒pSIN4-EF2-ABCG2-IRES-Neo的菌种可在Soc培养基中正确扩增和富集。 2.脂质体转染法介导pSIN4-EF2-ABCG2-IRES-Neo质粒进入病毒包装细胞HEK-293T，经G418筛选后，可得到含有目的基因BCRP的慢病毒。病毒滴度经测定为5×104 pfu/mL。 3.慢病毒感染MDCKⅡ细胞，经G418筛选后，可得到人源化高表达BCRP-MDCKⅡ细胞模型。RT-PCR和western blot结果表明，BCRP-MDCKⅡ细胞株可稳定高表达外源基因ABCG2。 ⅡH002临床前药代动力学研究 H002是一种新型鞘氨醇-1-磷酸受体1（Sphingosine1-phosphate receptorsubtype1，S1PR1）激动剂。与传统免疫抑制剂（如糖皮质激素、环孢素A、他克莫司等）的作用机制不同，H002在体内可逆地生成其活性形式—磷酸化产物H002-P，通过与S1PR1结合使其发生内陷，诱导淋巴细胞“归巢”，抑制淋巴细胞自外周淋巴结及次级淋巴器官的外流，从而发挥免疫调控作用。前期药理研究表明，H002对类风湿性关节炎、实验性银屑病等免疫性疾病动物模型均有较好的药效。此外，H002诱导的外周血淋巴细胞数降低可在停药后短时间内恢复至正常水平，对机体正常免疫功能的影响较小。 本研究根据临床前药代动力学指导原则，建立了生物样品中H002及其代谢产物的LC-MS/MS分析方法，应用已建立的LC-MS/MS方法研究了大鼠和Beagle犬口服和静脉注射H002后的全血药代动力学、分布（大鼠）和排泄特征;鉴定了H002生物转化的主要场所和参与代谢的主要药酶类型;研究了H002与大鼠、犬、猴、人的血浆蛋白结合及其对CYP450s和UDPGT活性的影响，为揭示药物在体内的动态变化规律及种属差异，阐明药效作用的物质基础，了解药物在体内代谢、排泄特点以及预测潜在的药物相互作用提供试验依据。研究结果表明: 1.生物样品中H002及其代谢产物测定方法(LC-MS/MS)的建立 大鼠全血基质中，H002及其磷酸化产物H002-P、羟化产物H002-M分别在0.2-100 ng/mL、0.25-100 ng/mL和0.2-100 ng/mL浓度范围内线性关系良好，未见明显基质和杂质干扰。H002、H002-P和H002-M质控样品(浓度分别为0.5、25、80 ng/mL，1.5、25、80 ng/mL，0.5、25、80 ng/mL，)的日内和日间精密度相对标准差均小于11.76％，准确度为±9.84％。 2.H002在大鼠体内的药代动力学研究 (1)大鼠口服H002后的全血药代动力学 雌雄大鼠口服H002(1、3、10、30 mg/kg)后5min血中可检测到H002、H002-P和H002-M，给药后72-144h各组动物血药浓度低于或接近检测限。 雌雄大鼠口服H002后，H002、H002-P和H002-M的Cmax和AUC(0-t)随剂量增加而递增，在1-30 mg/kg剂量范围内原型药、H002-P和H002-M在体内基本呈线性动力学过程，高剂量组t1/2和MRT(0-t)随剂量增加略有延长。 (2)大鼠静脉注射H002后的全血药代动力学 雌雄大鼠静脉注射H002后2min血中可检测到原型药及代谢物H002-P和H002-M，给药后48h各组动物血药浓度低于或接近检测限。 (3)大鼠口服H002后在体内主要组织的分布 大鼠口服H002(1 mg/kg)后原型药和代谢物在体内分布广泛。雄鼠给药后0.5 h组织和器官中原型药浓度排序为:胃＞小肠＞淋巴结＞肾上腺＞肺＞肝脏＞肾＞骨髓＞脂肪＞脾＞肌肉＞附睾＞心脏＞胸腺＞睾丸＞全血，脑中药物浓度低于最低定量限。雌鼠给药后0.5 h组织和器官中原型药浓度排序为:淋巴结＞胃＞小肠＞肾上腺＞肺＞子宫＞心脏＞卵巢＞肝脏＞肾＞骨髓＞脂肪＞脾＞肌肉＞胸腺＞脑＞全血。雌雄给药后4h、18h的分布趋势与0.5 h相似。H002-P和H002-M在各组织中的分布趋势和原型药相似。 (4)大鼠口服H002后自粪、尿、胆汁中的排泄 雌雄大鼠口服H002后在粪、尿、胆汁中均可检测到原型药、H002-P、H002-M和羟化产物的硫酸结合物(H002-OSO3)。 雄雌大鼠口服H002(1 mg/kg)后原型药和代谢物粪、尿总排泄量分别为给药量的57.01％和42.95％，主要经粪便途径。 (5) H002与大鼠、犬、猴和人的血浆蛋白的结合 H002(30、300和1500 ng/mL)与大鼠、犬、猴和人的血浆蛋白结合率为98.13-99.17％，提示H002与血浆蛋白高度结合，各种属间无明显差异，也未见明显浓度依赖性。 3.H002在Beagle犬体内的药代动力学研究 (1) Beagle犬口服H002后的全血药代动力学 Beagle犬口服H0020.3、1.8、10 mg/kg后5-30 min血中可检测到原型药、H002-P和H002-M(0.3mg/kg剂量组多数时间点H002-M的浓度均低于最低定量限)，血药浓度呈多峰现象，给药后384-1248 h各组动物血药浓度低于或接近检测限。 雌雄Beagle犬口服H002后，原型药和代谢物的Cmax和AUC(0-t)随给药剂量增加而递增，在0.3～10 mg/kg剂量范围内原型药及代谢物在体内基本呈线性动力学过程，高剂量组t1/2和MRT(0-t)随剂量增加略有延长。 (2) Beagle犬静脉注射H002后的全血药代动力学 雌雄Beagle犬静脉注射H002(0.1 mg/kg)后2min血中可检测到原型药和代谢物H002-P，多数时间点血样中代谢物H002-M的含量低于最低定量限(0.5ng/ml)。原型药和H002-P的血药浓度于给药后22 d和16d低于或接近检测限。 (3) Beagle犬多次口服H002后的全血药代动力学 Beagle犬连续口服H002(1.8 mg/kg)12天后血药浓度达到稳态，末次给药后雌雄犬血中原型药、H002-P和H002-M的药代动力学参数未见明显性别差异。与单次给药相比，末次给药后(24 h)原型药和代谢物的Gmax和AUC(0-t)均明显增加。 (4) Beagle犬口服H002后自粪、尿中的排泄 Beagle犬口服H002后粪、尿中均可检测到原型药、H002-P、H002-M及H002-OSO3。 4.H002的生物转化研究 大鼠、Beagle犬口服H002后在血、粪、尿、胆汁中可检测到多个代谢产物，包括磷酸化产物(H002-P)、羟化产物(H002-M)、羟化产物的硫酸结合物(H002-OSO3)。H002与大鼠/人伏/猴肝微粒体体外温孵后也可检测到代谢物H002-P和H002-M，体内外代谢产物具有一定的相关性，而H002-OSO3主要在体内生成。 体外代谢稳定性研究结果表明，H002(10μ M)与人工胃液、人工肠液、肠道菌群及大鼠血浆温孵6h后未见明显减少。与大鼠、犬、猴、人全血温孵6h后H002-P的生成量随温孵时间延长逐渐增加，提示全血可能是H002-P生成的主要场所。 H002与大鼠不同组织匀浆温孵后，H002-P的生成量依次排序为血＞肝脏＞脾脏＞脑＞胃＞淋巴结＞心脏＞肾＞肺＞小肠＞胸腺，H002-M生成量的排序为肝脏＞小肠＞肺＞脾＞淋巴结＞肾＞脑＞胸腺＞心脏＞胃，进一步提示H002-P生成的主要场所为全血，H002-M生成的主要场所为肝脏和小肠。 5.H002及其代谢产物对药物代谢酶的抑制/诱导作用 H002体外(1-10μM)对大鼠/人/犬/猴肝微粒体中的CYP1A2、CYP2C19、CYP4F2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2J2、CYP2E1的抑制作用为20.16％-40.33％。 6.H002在Caco-2和MDR1-MDCKⅡ细胞中的转运 H002在Caco-2和MDR1-MDCKⅡ细胞中的转运具有明显的方向性，当加入P-糖蛋白抑制剂PSC833后方向性消失，提示H002可能是P-gp的底物。 MDR1-MDCKⅡ细胞中H002对P-gp介导的地高辛转运活性具有一定的抑制作用，IC50为0.29μM。