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基因治疗有三个重要环节，即目的基因、转基因载体和靶细胞。基因导入系统是基因治疗的核心技术。目前，应用于基因治疗的载体主要有病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体转染效率高，是体内基因治疗的主要工具，但安全性存在隐患及有免疫原性，体内不能反复应用。而非病毒载体具有安全性高、免疫原性低、易于对DNA进行操作等优点，故人们愈来愈重视人工合成的非病毒载体的研究，而解决靶向性问题是非病毒中载体中最为关注的问题，理想的载体系统是能将治疗基因输送到并进入特定的靶细胞，从而能在该细胞中得到有效表达，这对于恶性肿瘤基因治疗尤为重要。以受体靶向的非病毒载体系统是最常用和有效的策略，利用细胞表面表达特异性的受体或蛋白，将特定的配体分子或片段与载体连接形成分子偶联体，使DNA能靶向性地转到表达受体的细胞。同时，针对非病毒载体的缺陷及DNA转移过程中的内吞小泡释放问题、转运入核问题，根据具体情况选择合适的载体，并对其作进一步的优化、改善以获得满意的治疗或应用效果。目前常用的非病毒载体包括裸DNA，脂质体载体及阳离子多聚物型载体等。聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是最常用的阳离子多聚物非病毒载体，PEI可把质粒DNA缩合(condense)成数百纳米大小的颗粒，通过静电作用黏附到细胞表面上，被动内吞。PEI在吞噬泡内不能降解，同时保护DNA免受溶酶体降解；另外，PEI有渗透性肿胀效应，导致吞噬泡破裂，使DNA进入胞浆，并促进DNA进入细胞核。本实验利用PEI作为载体系统的骨架，同时利用FGF受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)和整合素在大多数肿瘤细胞和肿瘤新生血管高表达的特点，设计了能与肿瘤细胞表面相应受体结合的寡肽：碱性细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)寡肽、靶向于整合素的RGD寡肽，利用交联技术将寡肽与PEI偶联，构建了新型的非病毒基因载体系统，以增加其对肿瘤细胞及其新生血管的靶向性，旨在用于恶性肿瘤基因治疗的研究。 研究分两部分：第一部分，PEI转染参数的测定及转染条件的优化。第二部分，靶向于FGFR的bFGF寡肽和靶向于整合素的RGD寡肽的设计与合成，bFGF寡肽／RGD寡肽单靶向的PEI转基因载体的构建及其介导基因转移的有效性和靶向性研究；bFGF寡肽和RGD寡肽联合靶向的PEI转基因载体的制备。习而绷眨甲巴泊.恨L月民之二自.月眨月睡冲全刁‘因月之，卜白匀月升门回中j忆按畏. 第一部分PEI转染效率的优化 目的:用分枝状25 kDa PEI作为转基因载体，介导报告基因质粒的转染，测定转染效率的多种影响因素，优化转染条件，为合成更复杂的载体积累数据。 方法:利用电泳阻滞实验测定PEI与DNA的结合能力。利用编码增强型绿色荧光蛋自的pEGFP质粒和编码p一半乳糖苍酶的PSVp质粒及Pc0NA3.甲质粒作为报告基因，通过PEI转染pEGFP质粒和psvp质粒及peDNA3.邓质粒，检测自蛋白、血清、稀释溶媒、氯喳等对PEI转染效率的影响，探索操作方法(包括转染次数、水平摇动、转染复合物与细胞温育的时间等)和质粒因素(质粒质量、纯度等)对转染效率的影响。通过MTT法测定PEI的细胞毒性。 结果:经过数据推导，得出PEI与ONA的N用比=7.53xb/c，其中N为PEI中的氮含量，P为DNA中的磷含量，b为PEI的质徽扭g)，‘为质粒的质量(雌)。PEI对COS一7细胞和NIH3T3细胞存在一定的毒性，其C50(50%死亡浓度)为7一8林g八111。电泳阻滞试验，PEI/D NA的N用比在2.5~3.0以上可完全阻滞DNA在电泳中的迁移。通过一系列细胞的研究，证明PEI心NA转染效率一般以N于=7.5~10最仕。生理盐溶液作为配制PEI心NA复合物的溶媒，转染效率高于5%葡萄糖溶液。溶酶体抑制剂氯哇降低PEI转染效果而且增加PEI细胞毒性。培养液中的自蛋自、血清显著降低转染效率。试验发现，新鲜制备的PEI心NA复合物转染效率>4oC放置24h>>一sooC冻存24h>>一Zooe冻存24h，<0.05)。 PEI心NA转染psVp后，12h不能测到目的基因表达产物，转染后24h目的基因开始表达，在36h表达量达峰值，并持续数大，然后表达量开始卜降。质粒中生物活性抑制剂(质粒提取试剂盒的残留成分，内毒素等)显著降低转染效率，通过超滤除去截流分子量小于30，000的物质，显著增加转染效率。转染效率与质粒用量呈剂量依赖效应。 结论:PEI是有效的体外真核细胞转染剂，可用于合成更复杂的转基因载体;本研究检测优化了PEI的转染条件井应用于卜而的实验研究。第二部分b「G「寡肤偶联的和整合素的RGD寡肤偶联的PE!载体的设计和制备 目的:设计合成新刑的bFGF寡肤靶向的PEI转基因系统、靶向于整合素的PEI转基因载体，研究该载体复合物系统用于基闪转移的效率。许多病毒感染细胞需要双受体机制，除细胞特异性受体外，整合素是许多病毒的第二受体，本研究模拟病毒双受体转染细胞的机制，制备整合素与FGFR双受体介导的PEI转基因载体。同时探讨核定位信号(nuc!ear locationalsignal，NLs)肤对pEI心NA转染效率的影响。 方法:根据bFGF(1 55 AA)的三维结构、bFGF分子与FGFR(fibroblast growth factor