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研究背景与人类共生的微生物群落数量庞大,它们广泛分布于人体的皮肤、口腔及胃肠道,其中寄生于胃肠道的微生物统称为肠道菌群,是人体微生态群落中最复杂的生物区。正常成年人肠道菌群重量可达1-2kg,数量多达1014,包含500-1000种不同类型,主要包括厌氧菌、兼性厌氧菌、好氧菌等,各菌群在胃肠道中按一定的比例、数量呈不同程度分布。它们在正常情况下保持动态平衡,对宿主维持机体健康是必需和有益的。正常肠道菌群具有消化营养、生物合成、生物屏障及促进免疫系统成熟的生理作用。生理情况下,肠道正常菌群与完整的肠黏膜结构、黏膜表面的粘蛋白、分泌型免疫球蛋白A (slgA)、及肠壁免疫细胞共同构成了肠道的黏膜屏障系统,阻止了肠道细菌及细菌产生的内毒素向肠外移位。但在各种病理状态下,维持菌群平衡的宿主条件受到破坏,引起菌群失衡。菌群失衡主要包括菌群比例失调与细菌移位两大类。比例失调是指肠道内的原籍优势菌生长受抑制而数量减少,而正常情况下占少数的细菌过度繁殖,两者比例失衡,破坏肠道微生态平衡。细菌移位(bacterial translocation, BT),是指细菌与细菌毒素产物(如内毒素)从肠腔进入肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes, MLN)和其他肠外器官与部位。多数情况下,内毒素血症是反映细菌移位的重要指标。由此可见,肠道是机体内最大的储菌库和内毒素池,亦是内源性感染和内毒素血症的主要来源。在某些病理情况下如肝硬化、重型肝炎、严重烧伤等可以出现肠道微生态失衡,肠屏障功能损伤,细菌及内毒素移位以及肠源性内毒素血症,严重影响患者生存质量。肝硬化是我国常见疾病,患者常死于感染、上消化道出血、肝性脑病等严重并发症。肠道菌群通过门静脉及淋巴系统,与肝脏不仅在解剖结构上建立了密切的关系,在生理功能上也有着紧密联系。一方面,肠道菌群可提供维生素K等促进肝脏凝血因子的合成,并可提高肝脏枯否细胞数量及功能,增强机体免疫功能；另一方面肝脏分泌的胆汁酸等维持肠道菌群的生态平衡。既往研究表明肠道菌群失调是肝硬化患者发生自发性腹膜炎、肠源性内毒素血症及肝性脑病等严重并发症的重要原因。李兰娟等通过宏基因组学研究发现肝硬化病人粪便细菌群落与健康人相比具有一定特征性,其粪便中肠杆菌科和链球菌科的增加及毛螺菌科的减少可能影响发病进程。动物实验亦显示肠道菌群紊乱在大鼠肝硬化模型并发症的发生发展中起着重要作用。但目前对肝硬化患者肠道菌群的大规模临床调查和研究较少,对菌群紊乱的具体菌属尚不完全明确,肠道菌群失衡是否影响患者预后尚不确切。研究目的本研究旨在以健康人为对照,观察不同分级下肝硬化患者肠道菌群及血清内毒素改变,并对肠道菌群失衡与肝硬化分级及预后的关系进行初步探讨,为肝硬化患者加强肠道屏障功能以及发掘新的益生菌制剂提供实验依据。材料与方法1、研究对象采集2010年9月至2011年9月问在广州南方医院住院明确诊断为肝硬化患者的粪便及外周静脉血液标本,另采集健康志愿者的粪便及外周静脉血液标本作为对照组。肝硬化组纳入标准参考中华医学会传染病寄生虫病学、肝病学分会联合修订的《病毒性肝炎防治方案(2000年9月·西安)》中肝炎后肝硬化的诊断标准以及2001年10月中华医学会肝脏病学会制定的《酒精性肝病诊断标准(草案)》中酒精性肝硬化的诊断标准确诊为肝硬化患者。正常对照组纳入健康人,排除急慢性肝胆及其它消化道疾病,常规检查未见异常。所以研究对象在采集粪便标本前4周均未应用抗生素及微生态制剂。2、粪便细菌培养天平称取0.5g粪便,用布氏肉汤进行连续10倍稀释(10-2～10-7)。根据不同的稀释倍数,取20uL菌液滴种于肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、酵母菌、拟杆菌、双歧杆菌、消化链球菌、乳酸杆菌、真杆菌及梭菌的选择性培养基上。每个稀释度在相应培养基中定量接种3个液滴,以便计算平均值。以上10种肠道细菌中,其中前4种为需氧菌,置于37℃普通培养箱培养48h,后6种为厌氧菌,置于厌氧培养箱中培养72h。观察结果并计数,以每克湿粪的菌落形成单位(colony forming unit, CFU)的对数值表示。3、粪便总DNA提取每例粪便样本称取200mg,按TIANamp Stool DNA Kit (TIANGEN)产品说明书,提取基因组DNA,并测定每份DNA样品的OD260/280值与浓度,于-20℃保存。4、细菌引物特异性检测取正常对照者的粪便DNA进行常规PCR反应。反应体系25μL:Premix Taq12.5μL,,上下游引物各1μL, DNA模板1μL, ddH2O9.5μL;反应条件：94℃预变性5mmin；94℃变性30s、退火30s(温度见表2)、72℃延伸1min,共30个循环：72℃最后延伸10min。以1000bp DNA Ladder为标准,用1.5%琼脂糖凝胶分析PCR扩增产物。5、细菌实时定量PCR检测将质粒标准品连续10倍稀释,获得101-107系列拷贝数的标准品作为模板,构建标准曲线。反应体系为20uL:SYBR Green Master Mix10uL,上下游引物各1uL,模板DNA5uL, ddH2O3μL;反应条件：95℃预变性5min；95℃变性l0s、退火温度(肠杆菌属58℃,肠球菌属52℃,乳酸杆菌属58℃,双歧杆菌属58℃,拟杆菌属60℃,梭菌属60℃)20s、72℃延伸30s,共45个循环；反应完毕后进行溶解曲线分析,判断产物特异性。将待测粪便DNA样品进行适当稀释后,体系与条件同上,进行荧光定量PCR反应。6、宏基因组学分析针对细菌16S rRNA的V4-V6区设计一对通用引物进行常规PCR反应。反应体系25μL:Premix Taq10μL,上下游引物各0.5μL, DNA模板SμL, ddH2O9μL;反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30s、59℃退火30s、72℃延伸45s,共25个循环：72℃最后延伸5min。将PCR产物用illumina HiSeq2000测序平台进行测序,得到数据进行聚类分析。7、血清内毒素含量检测所有研究对象的外周静脉血标本制得血清标本后,按照显色基质鲎试剂盒(厦门鲎试剂厂)说明书测定血清内毒素含量。8、统计学分析用SPSS13.0软件进行分析。细菌培养结果的数据用Mean±SD表示,其余计量资料的数据用M(中位数)表示。两样本比较采用两独立样本非参数检验中的Mann-Whitney U检验,多样本之间的比较采用多个独立样本非参数检验中的Kruskal-Wallis H检验,相关性比较采用Spearman秩相关检验,率的比较采用卡方检验。双侧P<0.05差异具有统计学意义。结果1、传统细菌培养与对照组比较,肝硬化患者肠杆菌(Z=-2.030,P=0.042)、葡萄球菌(Z=-1.974,P=0.048)、酵母菌(Z=-2.413,P=0.016)数量显著增加；拟杆菌(Z=-2.198,P=0.028)、乳酸杆菌(Z=-2.044,P=0.041)、梭菌(Z=-2.566,P=0.010)数量显著降低。2、细菌实时定量PCR比较对照组,肝硬化组肠杆菌(Z=-3.963,P=0.000)、肠球菌(Z=-6.762,P=0.000)数量显著增高；乳酸杆菌(Z=-7.093,P=0.000)、双歧杆菌(Z=-5.186,P=0.000)、拟杆菌(Z=-6.058,P=0.000)及梭菌(Z=-4.268,P=0.000)数量显著降低。3、宏基因组学分析肝硬化组与对照组相比,肠道菌群具有显著差异,并与肝功分级相关,且具有特征性的菌属,其中厚壁菌门的韦荣球菌科数量显著增加,疣微菌门、拟杆菌门的拟杆菌科、紫单胞菌科,厚壁菌门的氨基酸球菌属以及变形菌门的弧菌科数量显著减少。4、定量分析肝硬化患者不同肝功分级间菌群变化肠杆菌(x2=13.321,P=0.001)、肠球菌(x2=7.403,P=0.025)、拟杆菌(x2=13.425,P=0.001)、梭菌(x2=12.277,P=0.002)、乳酸菌(x2=9.314,P=0.000)及双歧菌(x2=6.760,P=0.034)的数量在肝硬化患者肝功能不同分级间存在显著差异。5、定量分析肝硬化患者菌群紊乱与预后关联肠杆菌数量与肝功Child分级(R=0.241, P=0.002)、CTP评分(R=0.235,P=0.003)、MELD预后评分(R=0.231,P=0.010)水平均呈正相关；乳酸杆菌、梭菌数量分别与肝功Child分级(前者R=-0.276,P=0.000；后者R=-0.532,P=0.000)、CTP评分(前者R=-0.280,P=0.000；后者R=-0.420, P=0.000)、MELD预后评分(前者R=-0.227,P=0.000；后者R=-0.435,P=0.011)均呈负相关。6、内毒素水平与肝硬化不同分级、预后关联与对照组比较,肝硬化组内毒素(Z=-7.593,P=0.000)水平显著增高。肝硬化组中,内毒素(x2=36.168,P=0.000)水平在不同肝功分级患者中存在显著差异,其水平随着肝功能的下降呈显著升高趋势；内毒素水平与肝功Child分级(R=0.44,P=0.000)、CTP评分(后者R=0.30,P=0.000)、XMELD预后评分(R=0.37,P=0.000)呈正相关。结论1、肝硬化患者普遍存在不同程度的肠道菌群失衡,其中肠杆菌数量的增加以及拟杆菌、乳酸菌与梭菌数量的减少在细菌培养及定量PCR中保持一致。2、肠杆菌数量的增加、乳酸杆菌及梭菌数量的减少,与肝硬化肝功分级严重程度及不良预后之间具有显著的正相关。3、梭菌有可能对肝硬化患者的病情预后起着一定的积极作用,可能成为一种新生的益生菌制剂,有待进一步研究证实。4、传统细菌培养、实时定量PCR对于细菌定量结果具有良好一致性。宏基因组学则更加直观、完整的反映肠道菌群的多样性,发现更多细微的菌群失衡。5、肝硬化患者普遍存在的内毒素血症可能是加速病情恶化及影响患者预后的重要因素。