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胃癌是高度危害人类健康的恶性肿瘤,其致死率位居所有肿瘤致死率的第二位。我国是胃癌高发国家,每年约有17万人死于胃癌,占消化系统肿瘤死亡人数的50%以上,临床治疗常以手术加术后放化疗为主。由于早期临床症状不明显,致早期诊治率较低;又因胃癌肿瘤细胞侵袭转移能力强,使得复发转移率较高,预后较差。胃癌的发生发展与癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关。抑癌基因乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(mammary serpin,maspin)在肿瘤细胞增殖、粘附、迁移和凋亡中起关键作用。因此,抑癌基因maspin很有可能成为治疗胃癌的潜在靶点。南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)又名过山风、降龙草、黄藤等,始载于清代《植物名实图考》,其(藤)茎、根、叶、果实、种子均可入药。属于卫矛科南蛇藤属植物,在我国分布较为广泛,主要用于抗炎镇痛、活血消肿、祛风解毒等。课题组前期研究发现,南蛇藤茎提取物(Celastrus Orbiculatus Extracts,COE)具有抑制肿瘤细胞的迁移侵袭与增殖,促进肿瘤细胞凋亡等显著抗肿瘤的能力。本研究构建了消减抑癌基因maspin表达的人胃癌MGC-803细胞,初步探索了 COE通过maspin促进人胃癌细胞凋亡的作用及其分子机制。加入不同浓度的南蛇藤提取物后,与对照组相比,一定浓度范围内(20、40、80μg/mL)的COE可以增加maspin的表达,并呈浓度依赖性,促进了肿瘤细胞凋亡。其分子机制,可能与B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl2)家族、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(casepase)蛋白以及磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶 B(phosphatidyl-inositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号通路相关。本研究共分为三部分。第一部分人胃癌组织样本中maspiin的表达及人胃癌MGC-803/maspin-细胞株的构建目的:观察人胃癌组织样本中maspin的表达,构建消减maspin表达的人胃癌MGC-803细胞模型。方法:利用免疫组化方法检测人胃癌组织样本中maspin的表达水平。体外培养人胃癌细胞MGC-803至对数期,利用RNAi技术,将maspin siRNA基因整合入MGC-803细胞DNA,使胃癌细胞MGC-803中maspin沉默表达,同时设立野生型细胞组及阴性对照组。转染24 h后,收集人胃癌MGC-803细胞,提取总蛋白和总RNA,分别利用western blot法和qRT-PCR技术,检测细胞中MASPIN蛋白和RNA的表达情况。结果:MASPIN蛋白表达于胃间质及非肿瘤胃腺组织的胞浆及胞膜中,在胃癌细胞中表达量降低。转染24h后,Western blot结果显示,与野生型细胞及阴性对照组相比,转染maspin siRNA的人胃癌细胞MGC-803细胞中,MASPIN的蛋白表达量显著减少。qRT-PCR结果也显示,与野生型对照组及阴性对照组相比,转染maspin siRNA的人胃癌细胞MGC-803细胞中maspin的RNA表达水平显著减少。结论:胃癌组织样本中MASPIN表达量降低。成功构建人胃癌MGC-803/maspin-细胞。第二部分南蛇藤提取物对人胃癌MGC-803/maspin-细胞增殖和凋亡的影响目的:研究南蛇藤提取物(Celastrusorbiculatus extracts,COE)对人胃癌MGC-803/maspin-细胞凋亡及增殖的影响。方法:对数期人胃癌MGC-803/maspin-细胞,加入不同浓度的COE(10,20,40,80,160,320 μg/mL)。同时设立阴性对照组、不加药野生型对照组和阳性对照组(加入32μg/mL的5-Fu)。倒置显微镜观察MGC-803/maspin-细胞形态变化;透射电镜观察药物对细胞超微结构的影响。MTT法检测不同浓度COE对人胃癌MGC-803/maspin-细胞增殖的抑制作用;以TUNEL实验结合流式细胞术检测不同浓度COE对人胃癌MGC-803/maspin-细胞凋亡的改变;JC-1实验检测药物对MGC-803/maspin-线粒体膜电位的改变。Transwell侵袭实验检测不同浓度COE作用后,细胞侵袭能力的变化。Transwell迁移实验和细胞划痕实验,检测不同浓度COE对人胃癌MGC-803/maspin-迁移能力的影响。结果:抑癌基因maspin沉默表达后,人胃癌MGC-803细胞的凋亡减少,增殖和迁移侵袭能力增强。不同浓度的COE作用后,MASPIN的表达水平增加,呈明显的浓度依赖性(P<0.05或P<0.01),1IC50为101.711 g/mL。结论:抑癌基因maspin在体外对胃癌细胞具有抑制作用;COE增加maspin的表达量且增强其功能,有效促进了人胃癌细胞MGC-803的凋亡,抑制了人胃癌细胞MGC-803的增殖和侵袭迁移能力。第三部分南蛇藤提取物通过抑癌基因maspin促进人胃癌MGC-803细胞凋亡的分子机制目的:研究不同浓度南蛇藤提取物(COE)对人胃癌MGC-803/maspin-细胞的凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、casepase-3)表达水平的影响,初步探讨COE促进胃癌细胞凋亡的分子机制。方法:对数期人胃癌MGC-803/maspin-细胞,为了避免细胞毒性作用的干扰,设置COE低浓度组(20,40,80 μg/mL),同时设立阴性对照组、野生型细胞对照组和阳性对照组(5-Fu 32 μg/mL)。药物作用24 h后,提取细胞总蛋白,Western blot法检测PI3K/Akt/mTOR 和 MAPK 信号通路关键蛋白(包括 MASPIN、Bax、Bcl-2、casepase-3、PI3K、Akt、mTOR、Erkl/2、p38MAPK及相应的磷酸化蛋白)的表达水平。结果:COE 降低 Bcl-2 及 PI3K、Akt,p-Akt、p-mTOR、Erkl/2 蛋白的表达水平,呈浓度依赖性;COE对mTOR、p38MAPK蛋白的表达无明显影响;随着COE浓度的增加,Bax、casepase-3、p-Erkl/2、p-p38MAPK蛋白的表达量呈现上升趋势。结论:COE促进人胃癌MGC-803/maspin-细胞的凋亡,其机制可能与Bcl-2家族、casepase-3 蛋白及 PI3K/Akt/mTOR、MAPK 信号通路有关。