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斑马鱼zINTL2基因是斑马鱼Intclcctin家族的一个成员,在实验室构建的杀鲑气单胞菌感染斑马鱼内脏细胞的抑制性差减杂交cDNA文库中出现的频率很高。斑马鱼zINTL2氨基酸序列的重要特征就是含有一段保守的FBG结构域,起着糖识别结构域的作用。FBG结构域后面还有一段保守的含有4个半胱氨酸的结构域,功能未知。Intelcctin是lectins家族中发现较新的一类基因,Intelectin分子中的FBG结构域与ficolin类似,ficolin是激活凝集素补体反应的一种分子,同时zINTL2分子是一种分泌型蛋白,与凝集素补体途径中的分子相似,由此我们预测intelectin途径可能与补体反应有关。
通过构建缺失FBG结构域的zlNTL2△AFBG蛋白的原核表达载体pET21b-zINTL2△FBG,进行了诱导表达,对以包涵体形式表达的蛋白进行了洗涤,变复性,Ni<2+>金属螯合层析等纯化步骤得到了一定纯度的重组zINTL2△FBG蛋白。
通过向斑马鱼腹腔注射zINTL2△FBG蛋白的方法进行免疫刺激,荧光实时定量PCR检测了不同刺激时间下游相关免疫基因的表达情况,结果显示该蛋白刺激前炎症因子IL-1β和TNF在24小时后分别上调20倍和17倍。提前7小时腹腔注射zINTL2△FBG蛋白,然后用杀鲑气单胞菌感染斑马鱼。首先从整体水平上观察存活率,结果显示zINTL2AFBG蛋白刺激后的斑马鱼死亡率提高。然后从分子水平上利用荧光实时定量PCR检测下游相关免疫基因的表达情况,结果显示IL-1β,IFN,TNF上调10-16倍,在16小时达到高峰。这些数据可以证明zINTL2△FBG蛋白直接或间接的激活了下游的免疫因子。
利用切片原位杂交的方法对斑马鱼zlNTL2基因进行了表达模式的研究分析。在正常斑马鱼中,zlNTl2在卵巢和肠道中表达。在杀鲑气单胞菌感染后的斑马鱼中,zlNTL2不仅表达量有增加,而且广泛的表达在卵巢,肠道,肝脏中。说明zlNTL2基因在感染后,从肝脏中分泌出来到全身起到免疫调节的作用。
此外,本文还构建了补体反应中关键分子C3的抗体,进行了初步的抗体特异性结合检测和Dot-Blot效价测定。为进一步研究Intelectin 2分子参与补体途径的功能研究奠定了基础。
总之,对zINWL2分子的切片原位杂交,分段蛋白表达纯化,免疫刺激活性等方面的研究,是首次在斑马鱼中对这类新的lectin分子功能上的初步探索,为我们更深入的了解Intelectin分子的功能、作用机制打下了良好的基础。