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目的构建土拉弗朗西丝菌novicida亚种Cpf1蛋白编码基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达、纯化重组Fn Cpf1蛋白后,将纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备兔抗Fn Cpf1多克隆抗体,间接ELISA法和Western blot分析制备抗体的免疫反应性及特异性。并对FnCpf1功能做初步的探讨。方法1.以土拉弗朗西丝菌novicida亚种基因组为模板,利用PCR技术扩增Fn Cpf1基因,将其克隆到原核表达载体p ET-32a(+)中,并用双酶切和测序验证。2.将构建成功的pET-32a(+)-FnCpf1重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达,通过镍离子金属螯合磁珠亲和纯化FnCpf1蛋白。3.将纯化蛋白浓缩液与弗氏佐剂充分混合,免疫新西兰大白兔制备FnCpf1多克隆抗体,并用间接ELISA法检测兔抗血清效价、Western blot鉴定其特异性。4.构建一个插入失活的mcherry荧光报告载体,将其转化至表达fncpf1蛋白的大肠杆菌感受态中,用肉眼直接观察是否出现红色菌落以判断是否进行了切割、重组。结果1.扩增得到3900bp目的基因片段,克隆到表达载体pet-32a(+)后,通过双酶切鉴定大小与预期一致,测序结果与genbank一致,证实pet-32a(+)-fncpf1表达载体构建成功。2.可诱导表达相对分子质量约为160kd的目的蛋白,经sds-page分析其为可溶性,通过镍离子金属螯合磁珠亲和纯化得到fncpf1纯化蛋白,imagelab的体积工具分析结果表明纯度为95%以上,bca法测得超滤浓缩后的纯化蛋白浓度为1.4mg/ml。3.用纯化蛋白免疫新西兰大白兔3次后,制备多克隆抗体并检测兔抗fncpf1抗血清elisa效价达1:512000,westernblot结果显示制备的抗体可较好地与fncpf1蛋白特异性结合。4.将插入失活的mcherry荧光报告载体转化至表达fncpf1蛋白的大肠杆菌感受态中,平板上可见红色菌落长出,而转化至大肠杆菌dh5α的则未见红色菌落。结论1.成功构建了fncpf1重组表达载体,并在原核系统中诱导、表达和纯化fncpf1重组蛋白。2.用纯化后的蛋白制备出兔抗fncpf1抗体,效价及特异性均良好,为进一步探讨cpf1蛋白的生物学特性打下实验基础。3.在表达FnCpf1的大肠杆菌中,利用CRISPR-Cpf1系统对插入失活的mCherry红色荧光报告基因进行靶向切割并重组,证明了FnCpf1蛋白的核酸酶活性。