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该论文采用PCR技术从人胎脑cDNA库中扩增了人内皮细胞抑制素基因.经DNA序列分析后将扩增的基因克隆至酵母载体pPIC9K,获得的重组质粒pPIC9K-EDN转化毕节酵母GS115,构建能表达内皮细胞抑制素的酵母工程菌P.pastoris GS115(pPIC9K-EDN).SDS-PAGE分析结果显示:人内皮细胞抑制素在酵母工程菌GS115(pPIC9K-EDN)中获得高效表达,表达量达45mg/L.在此基础上进行了工程菌高密度发酵和产物和纯化及生物活性分析.首先在摇瓶中对工程菌生长、表达的最适条件(培养基,pH,诱导时间)进行了模索,确定了发酵的最适培养基,pH和诱导时间.然后在30L发酵缺罐中研究了内皮细胞抑制素酵母工程菌P.pastoris GS115(pPIC9K-EDN)的高密度发酵工艺,通过甘油培养24h和甲醇诱导48h后,工程菌GS115(pPIC9K-EDN)生物量的A<,600>值达到250,分泌量为150mg/L.发酵液经Streamline SP,SP Sepharose FF离子交换柱和Sepharose Heparin Hi Trap亲和柱纯化,产物纯度达97％以上,回收率为60％.该实验对汉森酵母YIp型表达载体pSML12进行改造,引入了Hansenula wiginii的25s rDNA片段和Kanamycin抗性基因,构建高拷贝表达载体pLRG29.将带有MFα1因子信号序列的EDN基因cDNA克隆至pLRG29,获得的重组质粒pLRG-EDN转化H.polymorpha A16,构建可高效表达EDN的工程菌H.polymorpha A16(pLRG-EDN).为了检验毕节酵母AOX1基因启动子能否在汉森酵母中启动EDN基因的表达,对毕节酵母表达载体pPIC9K-EDN进行了改造,在其中引入了与H.polymorpha A16匹配的营养选择标记LEU2和Hansenula wiginii的25s rDNA片段,构建重组质粒p9KRL-EDN,并用p9KRL-EDN构建工程菌H.polymorpha A16(p9KRL-EDN).对构建的两株工程菌进行了摇瓶发酵研究,SDS-PAGE结果显示EDN基因在截短的MOX启动子调控下,在工程菌H.polymorpha A16(pLRG-EDN)中获得分泌表达,表达量约为65mg/L,但对甘油的脱阻遏能力降低.