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通过特定的毒力分泌系统向宿主细胞注入效应蛋白是病原细菌普遍采用的致病机制，其中三型分泌系统（TypeⅢ secretion system，T3SS）是革兰氏阴性病原细菌重要的毒力分泌系统，研究其调控机制对控制病原细菌的感染具有重要意义。耶尔森氏菌属(Yersinia)的3种人类病原细菌均通过其毒力质粒(pYV或者pCD)编码的三型分泌系统(Ysc-Yop T3SS)将一系列毒力效应蛋白(Yops)注入到宿主细胞内，发挥不同的功能达到致病的目的。耶尔森氏菌Ysc-Yop T3SS的组装及Yops的分泌受到非常复杂精细的调控，但目前对Ysc-Yop T3SS调控机制还有很多不清楚的地方。本论文对毒力质粒编码的T3SS装置蛋白YscV以及由染色体编码的Rcs双组分系统的应激调控蛋白RcsB调控Ysc-Yop T3SS的分子机理进行了研究，主要包括以下2方面的工作: 1.探究了T3SS输出装置蛋白YscV调控Ysc-Yop T3SS的分子机制。通过构建毒力质粒上的基因过表达文库，筛选可以调控T3SS表达的基因，结果发现T3SS装置蛋白编码基因yscV在其中起到重要作用，缺失或者过表达yscV都会抑制Yops蛋白的合成，并证明该抑制作用主要是通过阻滞LcrQ的分泌过程而实现的。LcrQ是pYV毒力质粒编码的一个负调控因子，抑制Ysc-Yop T3SS的表达。在Ysc-Yop T3SS诱导激活情况下，LcrQ可以分泌到胞外从而激活Ysc-YopT3SS。缺失lcrQ基因后，YscV过表达的负调效应消失。进一步的细菌双杂交及Pull-down分析结果均表明YscV的C端可溶性的胞质段493-511氨基酸区域与LcrQ存在直接的相互作用，缺失该部分氨基酸(YscV△493-511)导致LcrQ不能够分泌到胞外，造成LcrQ大量积累到胞内从而引起对Yops毒力蛋白合成的反馈抑制作用，所以YscV与LcrQ相互作用形成复合体是LcrQ分泌所必需的。基于以上结果，提出了依赖于YscV的LcrQ分泌过程对于Yop合成的反馈抑制模型。低水平表达量的YscV可以使得Ysc-Yop T3SS正确组装，LcrQ分泌到胞外，Yops蛋白得到表达;但是高表达的YscV破坏了Ysc-Yop T3SS的装配，造成LcrQ分泌水平的下降，大量积累到胞内，从而抑制Yops蛋白的合成。该结果揭示了分泌装置蛋白YscV在主调控蛋白LcrQ分泌过程中的功能，为进一步系统阐释T3SS负反馈调控机制提供了重要基础和新的思路。 2.系统分析了Rcs双组分系统调控Ysc-Yop T3SS的分子机制。Rcs双组分系统是病原细菌感受外界环境信号刺激，参与调控生命活动如鞭毛合成等的重要信号传导系统，但该双组分系统是否调控耶尔森氏菌Ysc-Yop T3SS还没有报道。我们首先筛选到了该双组分系统的应激调控蛋白RcsB在pYV毒力质粒上的靶标基因，包括virG-lcrF操纵子和yopJ等。体外蛋白质-DNA结合分析确证RcsB可以特异性的直接结合这些靶标基因的启动子区域，促进lcrF和yopJ基因的转录，这种转录激活作用依赖于RcsB的磷酸化状态，并且RcsB可以通过LcrF的转录激活作用全局性调控Ysc-Yop T3SS。在Rcs系统的持续性磷酸化点突变菌株中，virG-lcrF操纵子和Yops蛋白的表达水平得到上调，说明Rcs系统的磷酸化传递对于其调控Ysc-Yop T3SS是必须的。进一步的细胞水平的研究结果表明，Rcs系统可以通过其磷酸化状态增强YopE和YopH效应蛋白迁移到RAW264.7细胞中的水平，并提高细菌在免疫细胞中的存活水平。通过寻找Rcs系统调控T3SS的激活信号，发现Zn2+可能具有激活效应。另外，还发现RcsB在Ysc-YopT3SS诱导和非诱导情况下会发生一个分子量迁移的现象，可能与耶尔森氏菌特有的低钙反应有关。本研究首次证明了Rcs系统可以调控耶尔森氏菌Ysc-YopT3SS，并且首次发现RcsB蛋白是已知的第一个正调全局性转录调控因子LcrF表达的调控蛋白，为进一步深入研究病原细菌如何感受外界环境信号启动T3SS相关基因的表达提供了借鉴。