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花生(Arachis hypogaea L.)是我国重要的油料作物之一,在国民经济中发挥重要作用。黄曲霉毒素污染是制约花生产业发展的最大限制因素,而培育抗性品种是解决花生黄曲霉毒素污染问题最有效和最经济的方法。由于目前花生对黄曲霉毒素污染寄主的抗性分子机理尚未清晰,导致抗性品种选育的成效低、进程缓慢。针对这一问题,本研究采用基因芯片杂交技术和蛋白组学方法,通过比较黄曲霉抗性品种(YJ-1)和易感品种(Yueyou-7)在受黄曲霉菌侵染条件下种子蛋白质和基因表达谱变化的差异,挖掘与黄曲霉抗性相关基因和蛋白质,并对其中关键候选基因AhGLP的特征特性及抗黄曲霉功能进行分析。该研究对在科学上阐明花生黄曲霉抗性的分子机制,挖掘花生抗黄曲霉相关基因或蛋白质,为下一步通过分子设计育种培育抗黄曲霉花生品种,减少或解决花生黄曲霉毒素污染具有重要的理论和现实意义。
本论文研究结果表明:
1.采用蛋白组学方法,通过比较抗黄曲霉品种和易感黄曲霉品种在正常条件(CK)、干旱胁迫、干旱胁及人工接种黄曲霉菌处理下种子蛋白质差异表达,鉴定筛选出12个与黄曲霉抗性相关的特异表达蛋白,其中包括4个胁迫相关蛋白质(包括AhGLP1(OXO,花生类萌发素蛋白)、POD、TI和HSP)、3个信号传导相关蛋白(包括Os07g0179400、CDKD1和RIO kinase)、3个转录调节类蛋白(SAP结构域蛋白质、50S核糖体蛋白L22和拟30S核糖体蛋白S9)和2个贮藏类蛋白(PⅡ蛋白和iso-Ara h3)。实时定量PCR验证分析表明,7个蛋白质点的表达与其mRNA水平表达一致,而另外5个蛋白质与其mRNA表达不一致。其中AhGLP1是在抗性品种中特异表达量最高的蛋白质点之一。
2.采用基因芯片杂交方法,通过比较抗黄曲霉品种和易感黄曲霉品种在正常条件(CK)、干旱胁迫、干旱胁及人工接种黄曲霉菌处理下种子基因差异表达,结果表明:(1)与对照组相比,在干旱诱导下,抗-感品种分别有2487和1969个基因上调表达,2281和1703个基因下调表达。(2)与干旱胁迫相比,在干旱及黄曲霉胁迫下,抗-感品种分别有293和1719个基因上调表达,688和2085个基因下调表达。(3)通过比较抗-感品种在干旱和黄曲霉侵染条件下基因表达谱,鉴定筛选出490个基因在抗性品种中的表达量显著高于或低于易感品种,其中296个基因有功能注释；通过对差异基因进行功能聚类和富集度分析,鉴定出106个基因与抗收获前黄曲霉侵染显著相关,主要包括20个跨膜运输相关基因、19个糖类合成代谢相关基因、18个防卫反应基因、13个脂质代谢相关基因、12个磷酸化反应相关基因、8个细胞周期相关基因、6个信号转导途径基因、6个能量代谢相关基因、4个辅酶合成基因以及少量其它功能类基因。(4)在抗-感花生种子中,一些AhGLP家族基因受干旱或黄曲霉诱导表达,其中AhGLP1仅在抗性品种中响应黄曲霉侵染诱导表达,这与蛋白质组学分析结果一致。
3.序列同源分析表明AhGLP是一个多基因家族,其中AhGLP1是成员基因之一。基于基因数据库已知的序列进行同源克隆,获得7个AhGLP家族基因全长ORF序列。序列分析表明,AhGLP1、AhGLP3、AhGLP4、AhGLP5和AhGLP7分别存在3、3、4、7和10个碱基突变,突变基因分别命名为AhGLP1a、AhGLP3a、AhGLP4a、AhGLP5a和AhGLP7a。生物学信息学分析结果表明,AhGLP家族蛋白质都有相似的氨基酸组成和三级结构,其序列同源性为27％-99％,而与其它物种GLP家族蛋白质的同源性为32％-79％,其中与葡萄属GLP家族的同源性最高。
4、采用荧光定量PCR对AhGLPs家族基因在花生根、茎、叶、花、花蕾以及种子发育和萌发过程的表达情况进行分析,结果表明:GLPs家族基因在不同的组织或器官以及不同发育过程均存在很大差异:在果针中AhGLP1α的表达最高,在种子启动萌发时仅AhGLP3α有表达,在老根和种子萌发过程中AhGLP家族基因均有较高表达,在幼根中AhGLP1α和AhGLP2的表达最高,在14d龄的茎中AhGLP1α和AhGLP3α的表达最高,在14d龄的叶中AhGLP2、AhGLP3α和AhGLP4α的表达最高,在花蕾中AhGLP4α和AhGLP5α的表达最高。
5.对AhGLP各家族基因在花生抗黄曲霉毒素污染中的功能进行分析,结果表明,(1)在干旱的条件下,黄曲霉菌可诱导AhGLP1α、AhGLP2、AhGLP3α、AhGLP4α和AhGLP5α的表达逐渐升高,在侵染后15d达到最高,表明这5个成员基因可能与抗收获前黄曲霉毒素污染相关；(2)对收获后花生种子受黄曲霉菌侵染后AhGLP各成员基因的表达情况分析表明,AhGLP家族各成员基因均发生显著上调表达,可能与抗收获后黄曲霉毒素污染有关；(3)构建8个成员基因的原核表达载体,获得4个原核表达蛋白(AhGLP1,AhGLP2,AhGLP3和AhGLP7),纯化后的原核表达蛋白体外抑菌试验表明:4个成员基因原核表达蛋白均不能抑制黄曲霉菌生长；(5)构建AhGLP家族8个成员基因超表达载体,并转化拟南芥,获超表达植株,提取超表达植株叶片粗蛋白进行体外抑菌分析,结果显示,野生型和所有成员基因超表达的转基因拟南芥叶片提取粗蛋白均不能抑制黄曲霉生长,表明AhGLP家族基因在抗性反应中并不直接作用于黄曲霉菌。(6)对各成员基因超表达转基因拟南芥的防卫相关基因表达进行分析,结果显示,转AhGLP拟南芥植株中PR类基因和黄酮类代谢相关基因的表达量明显升高,表明AhGLP家族基因的超表达可提高整体植株的防卫基因体系基因的表达,从而达到抵御外界病原菌的侵染。
6.为了进一步了解AhGLP家族基因的在花生中调控表达机制,采用不同的生物和非生物胁迫处理,研究其表达模式,结果表明:(1)在高盐胁迫下,花生叶中的AhGLP1α和AhGLP5以及根中的AhGLP1α、AhGLP3α、AhGLP6和AhGLP8的表达明显上调,而叶中的AhGLP2、AhGLP3α、AhGLP4α和AhGLP6以及根中的AhGLP2的表达明显降低。对超表达转基因拟南芥的耐盐性进行分析,结果表明,盐胁迫下,转AhGLP2和AhGLP3α拟南芥种子的萌发率及存活率明显高于其它转基因株系,表明AhGLP2和AhGLP3α成员基因可能与耐盐性相关；(2)在H2O2处理下,叶中AhGLP2、AhGLP3和AhGLP5α以及根中AhGLP3、AhGLP6、AhGLP7和AhGLP8的表达明显上调,而叶中AhGLP4α和根中AhGLP2的表达量降低；(3)在人工机械损伤条件下,叶中AhGLP1a和AhGLP2的表达量不断上调,AhGLP4α、AhGLP5α和AhGLP8的表达先上升后下调；(4)在叶斑病菌、锈病菌和花叶病菌侵染下,AhGLP2、AhGLP3α、AhGLP5α、AhGLP7α和AhGLP8的表达均显著上调,AhGLP1α和AhGLP6的表达仅受叶斑病和花叶病诱导上调,AhGLP4仅受花叶病诱导上调表达；(5)在SA处理5h,叶中AhGLP2、AhGLP3α、AhGLP4α、AhGLP5α、AhGLP7α和AhGLP8的表达均显著上调,而AhGLP6的表达受SA抑制,表明AhGLP家族基因的诱导和调控表达可能与SA信号途径有关；(6)ABA处理下,花生叶中AhGLP1α、AhGLP2、AhGLP3α、AhGLP5α和AhGLP8的表达量先升高,后逐渐降低。AhGLP4和AhGLP7的表达随处理时间延长不断升高,AhGLP6对ABA响应不明显。转基因拟南芥种子的萌发率明显降低,其中转AhGLP4和AhGLP7拟南芥种子的萌发对ABA最敏感。
综上所述,花生抗黄曲霉侵染和毒素是一个复杂的多基因调节的过程。AhGLPs家族是一类同源性差异较大、表达功能多样的调节基因,其通过SA和ABA信号途径,在调节花生抗黄曲霉、叶斑病、锈病和花叶病等生物胁迫以及盐害、损伤和H2O2处理等非生物胁迫的反应中起到重要作用。