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炎性反应过程中血清淀粉样蛋白A转录激活因子（SAF）参与炎性反应基因转录调控，研究调控SAF蛋白本身的转录和该基因转录与前体mRNA的剪接关系对进一步揭示心脏疾病、风湿性关节炎等慢性炎性疾病的发病机制有重要意义。本研究拟利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作用于人单核白血病细胞（THP-1细胞）建立炎性细胞模型，探讨炎性刺激条件下SAF基因编码区组蛋白修饰及RNA聚合酶II富集情况的表观遗传学机制。 第一部分LPS对THP-1细胞分泌炎性相关细胞因子的影响 目的：建立炎性细胞模型，研究LPS对THP-1细胞分泌炎性细胞因子及相关基因的影响。 方法：1.ELISA检测LPS刺激THP-1细胞上清中炎性细胞因子分泌的变化。 2.采用细胞免疫荧光检测LPS刺激THP-1细胞后对NF-κB信号通路的影响。 3.应用均匀设计优化实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的实验条件，分析11个候选内参基因（RPL37A、ACTB、GAPDH、B2M、PPIB、PGK1、PPIA、SDHA、TBP、HPRT1和RPL13A）在LPS刺激THP-1细胞和（或）K562细胞前后不同时间的表达稳定性。 4.采用RT-qPCR检测炎性刺激条件下IL-1β、IL-10、IL-12p40和IL-18等基因转录的变化。 结果：1.10μg/mLLPS作为炎性刺激介质具有促进炎性细胞因子分泌的作用，LPS作用下IL-1α和TNFα首先开始分泌，炎症进展过程中因为IL-1α和TNFα的存在IL-6的分泌能力增强。 2.细胞免疫荧光结果显示10μg/mLLPS具有促进NF-κBp65核转位的作用，核转位率有时间依从性。 3.通过均匀设计，完成对cDNA模板量、引物浓度和退火温度3因素8水平的实验条件优化，建立候选内参基因RT-qPCR检测的最佳组合为cDNA模板量0.5μg、引物浓度200μmol/L、退火温度55℃。 4.经geNorm、BestKeeper和NormFinder软件分析可知，PPIB和PGK1在THP-1细胞和K562细胞中表达稳定，RPL13A的稳定性差；THP-1细胞和K562细胞的实验中同时选用PPIB和PGK1有助于得到更可靠的结果。单独筛选THP-1细胞稳定的内参基因为GAPDH和PGK1。 5.内参基因PGK1校正RT-qPCR结果显示10μg/mLLPS可以显著增加促炎细胞因子IL-1β的表达，加速初期炎症反应的进程。IL-12p40mRNA的表达高峰明显滞后，IL-12可能在炎症反应进展过程中持续发挥促进作用而形成“瀑布效应”。抗炎细胞因子IL-10仅在炎症反应初期有所增高，而后快速下降维持低水平表达。 结论：1.10μg/mLLPS作为炎性刺激介质能够激活THP-1细胞分泌炎性相关细胞因子。 2.实验建立的炎性细胞模型可以用于后续实验。LPS刺激THP-1细胞激活NF-κB决定细胞内炎性反应的发生，NF-κB的激活保证后续研究SAF转录激活因子在炎性反应基因转录调控中的作用。 第二部分LPS刺激对SAF基因编码区组蛋白修饰及RNA聚合酶II富集情况的表观遗传学机制研究 目的：通过染色体免疫共沉淀（ChIP）实验检测SAF转录激活因子基因编码区外显子e4A和e4B区域的组蛋白表观遗传学信息。 方法：收集LPS刺激或未刺激的THP-1细胞，甲醛固定、超声波将染色体打碎成200bp~1000bp理想大小的片段，选用抗组蛋白H3抗体、抗组蛋白H3K36三甲基化抗体、抗组蛋白H3K9单甲基化抗体和抗RNA聚合酶IICTD重复区5号丝氨酸磷酸化抗体将相应DNA/组蛋白复合物沉淀下来，酚氯仿提取并纯化得到的DNA，以此为模板运用半定量PCR扩增检测SAF基因编码区组蛋白遗传信息。 结果：1.LPS炎性刺激影响SAF基因编码区外显子e4B的剪接，表现为外显子e4B保留的剪接变异体mRNA减少，即剪接体SAF-2减少。 2.LPS炎性刺激条件下内含子i4a、外显子e4B及内含子i4b被切除的mRNA转录表达产量减少，即SAF-1和SAF-3mRNA的产物总量减少。 3.LPS炎性刺激导致SAF基因编码区外显子e4A和e4B组蛋白H3信号减弱、组蛋白H3K36三甲基化信号减弱不明显；e4A区域RNApolIICTD重复区5号丝氨酸磷酸化水平降低。 4.LPS炎性刺激导致SAF基因e4A区域组蛋白H3K9单甲基化信号明显减弱。 结论：1.炎性刺激作用下SAF基因编码区组蛋白H3的富集信号减弱，提示组蛋白H3离散（eviction），该区域核小体解散、凝聚的染色体重塑呈开放构象、含SAF编码区基因信息的DNA暴露，利于RNApolII转录延伸。组蛋白H3在编码区的离散可能是组蛋白乙酰化的结果，组蛋白的乙酰化可能对聚集在该区域的RNApolII转录延伸有正效应。 2.LPS刺激时SAF基因外显子e4A区域单个核小体上H3K9单甲基化水平减弱、H3K36me3修饰富集水平增加、RNApolIICTD重复序列第5号丝氨酸磷酸化水平降低，说明此时SAF基因RNApolII转录延伸活跃。 3.LPS刺激THP-1细胞条件下SAF基因外显子e4B保留和切除的转录子表达均减少。 4.SAFmRNA水平的调控是多因素调控的平衡。