【摘 要】
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目的:1.构建成人生精小管cDNA表达文库;2.利用复合酶消化合并非连续Percoll梯度法从成人生精小管中分离纯化生精细胞.方法:本研究以成人生精小管为研究对象:1.通过Trizol法,
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目的:1.构建成人生精小管cDNA表达文库;2.利用复合酶消化合并非连续Percoll梯度法从成人生精小管中分离纯化生精细胞.方法:本研究以成人生精小管为研究对象:1.通过Trizol法,从成人生精小管中提取总RNA,经Oligo(dT)-纤维素法分离纯化mRNA,逆转录生成双链cDNA,克隆至表达质粒载体pSPORT I,经高效电转化至DH<,5a>大肠杆菌中,构建成人生精小管cDNA质粒表达文库,同时对二个表达序列标签(EST)进行分析.2.以复合酶消化结合非连续Percoll梯度离心,尝试从成人生精小管中快速分离纯化生精细胞.结果:1.cDNA文库的容量大致为1.1×10<6>cfu,重组率约为93﹪,插入片段的平均长度约1.3kb,表明构建文库的质量较好;2.其中一条EST同促性腺激素释放激素受体2(gonadotropin-releasing hormone receptor 2)在蛋白水平具有31﹪的同源性,而另外一条EST在蛋白水平与钙调蛋白存在26﹪的同源性,发现其含有一段编码128个氨基酸的开放阅读框并可能存在一个保守结构域(conserved domains,CD),与钙调蛋白及其相关蛋白家族的结构域(151个氨基酸构成)存在60.9﹪的相关性,上述ESTs GeneBank登录号为:CN445900,CN445899;3.通过合理的复合酶消化并设置22﹪-30﹪-35﹪-40﹪四层非连续Percoll梯度分离发现:22﹪梯度处主要为精子细胞,纯度为91.7﹪;30﹪梯度处细胞密度最大(P<0.05),富含各级未成熟的生精细胞,含量为88.6﹪.结论:1.成功构建了成人生精小管cDNA质粒表达文库;2.发现一条可能代表人促性腺激素释放激素受体同源蛋白的EST,另一所编码的蛋白考虑为钙调素的同源蛋白;3.将复合酶消化合并非连续Percoll梯度法应用于分离成人生精小管精子细胞和未成熟生精细胞.
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