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目的:放疗是肿瘤治疗的重要有效手段之一。近年来，随着对放射生物学的深入研究发现，高能X射线作为放射治疗的重要方法，一方面利用其穿透力，使肿瘤细胞内部发生电离效应，破坏癌细胞的DNA结构，抑制或杀死肿瘤细胞；另一方面，射线通过诱导肿瘤细胞释放HMGB-1、HSP70等内源性“危险信号”而提高肿瘤细胞的免疫原性，同时会上调MHC-I和ICAM-1、VCAM-1等粘附分子的表达，进而趋化免疫细胞，并激活宿主固有免疫应答甚至是适应性免疫应答。因此，放疗不仅仅是通过破坏肿瘤细胞生存所需要的信号分子影响细胞的生长，对机体抗肿瘤免疫也具有免疫调节作用。越来越多的基础和临床的研究表明，对肿瘤采取适当的联合治疗，可以取得更好的疗效。其中放疗联合免疫疗法的抗肿瘤作用越来越得到人们的认可。本研究主要是观察高能X射线与DC疫苗是否具有协同抗肿瘤作用，并对相关的免疫机制做初步研究和分析。方法:1观察X射线对4T1细胞凋亡诱导作用采用X射线照射，剂量为10Gy/次，间隔24小时连续照射三次，于末次照射后24小时，流式细胞仪检测细胞凋亡率。2HMGB-1和TGF-β蛋白表达水平的检测体外培养小鼠乳腺癌4T1细胞至对数生长期，用X射线照射，剂量为10Gy/次，间隔24小时连续照射三次，于末次照射后24小时，收集细胞，提取细胞总蛋白，Western blot方法观察HMGB-1和TGF-β蛋白表达。3DC疫苗制备、活性及其抗原呈递能力检测颈椎脱臼法处死BALB/c小鼠，取小鼠股骨的骨髓细胞，利用细胞因子GM-CSF和IL-4诱导树突状细胞分化，在培养的第5天，重新收集细胞计数，调节细胞数至1×106/ml，重新加入24孔细胞培养板，加入X射线处理的4T1肿瘤细胞裂解液（终浓度50μg/ml），在37℃含饱和水气、5%的CO2培养箱中孵育16小时，然后再用LPS（100ng/ml）或TNF-α（10ng/ml）刺激36h进一步诱导DC成熟。以PBS做阴性对照。流式细胞仪分析CD11c+细胞的MHC II，ICAM-1，CD86的表达。用终浓度25μg/ml的丝裂霉素C处理的DC细胞做为刺激细胞，反应细胞是雌性C57BL/6小鼠的脾细胞。将反应细胞和刺激细胞分别以200：1、100:1、50:1的比例加入到96孔U型板中孵育96小时，孵育完成之前的4h每孔加入20μl CellTiter96AQueous One Solution Reagent。用MTS比色法来检测反应细胞增殖情况。4分析X射线联合DC疫苗的抗肿瘤作用及其机制将4T1细胞经皮下接种给雌性、7-8周BABL/c小鼠（6只/组），X线照射方法为两种，间隔24h连续照射3次，每次10Gy，或30Gy照射1次。然后于瘤内注射DC疫苗（1×106/只），接瘤后每天观察肿瘤生长情况；分析肿瘤浸润淋巴细胞TIL（tumor-infiltrating lymphocytes）中相关的CD8+T细胞和T-Reg细胞数；检测荷瘤鼠脾脏中肿瘤抗原特异性淋巴细胞的CTL活性、T-Reg细胞数以及IFN-γ的分泌。利用Real-time PCR方法分别分析肿瘤细胞和TIL中的细胞因子IL-6、IL-10的表达以及趋化因子CXCL16/CXCR6的表达，并对肿瘤信号通路蛋白stat3和NF-κB的表达进行Western分析。结果:1采用X射线剂量为10Gy/次照射，间隔24h连续照射三次的方法处理体外培养的4T1细胞，可以诱导细胞凋亡，也可以引起细胞死亡。凋亡率14.88%。于末次照射后24小时，观察到HMGB-1的表达有增多趋势，而TGF-β表达有减少趋势。2X射线处理的4T1细胞裂解液联合LPS明显促进DC的活化。与对照组相比，抗原刺激后经LPS诱导的表达CD11c表面标记的DC细胞中ICAM-1、MHC II及CD86的表达明显增多。4T1细胞裂解液负载联合LPS组的DC可以明显刺激同种异体的T淋巴细胞的增殖，并随DC数目的增多而增强。3X射线联合DC疫苗显著抑制肿瘤细胞的生长，其中10Gy/次，间隔24h连续照射3次联合DC疫苗组，肿瘤生长最缓慢；且该组小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ的产生和CTL活性也最强。X射线联合DC疫苗可上调肿瘤组织CD8+T细胞数，虽然对T-Reg细胞数的调节作用不明显，但可增加CD8+T/T-Reg的比例。4与对照组相比，10Gy/次，间隔24h连续照射3次联合DC疫苗组的肿瘤细胞中的IL-6、IL-10表达明显下调，CXCL16表达有上调趋势；TILs中CXCR6的表达明显上调；IL-6、IL-10表达无明显变化。与对照组相比，10Gy/次，间隔24h连续照射3次组的stat3蛋白的活化受到抑制；NF-κB的表达无明显变化。结论:1X射线促进4T1细胞的HMGB-1的表达，减少TGF-β表达；2X射线处理的4T1细胞裂解液联合LPS明显促进DC的成熟、活化及抗原呈递能力；3X射线联合DC疫苗有协同抗肿瘤作用；4X射线联合DC疫苗明显上调肿瘤组织和荷瘤鼠脾脏CD8+T细胞数，对T-Reg细胞调节作用不明显。但可增加CD8+T/T-Reg的比例；5X射线联合DC疫苗抑制了stat3-IL-6信号通路，有利于改善肿瘤免疫微环境。