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目的：
构建EGF-IL-18融合基因的原核表达载体，分离纯化有活性的EGF-IL-18融合蛋白，使用发酵技术大量培养工程菌，得到大量重组EGF-IL-18融合蛋白，为进一步研究其体外和动物体内的生物学作用奠定基础。
方法：
1.EGF-IL-18融合蛋白原核表达载体的构建和表达采用PCR方法，以质粒pFUS-EGF-IL-18为模板，扩增EGF-IL-18融合基因，并将其分别亚克隆入原核表达质粒pET12a(+)、pET26b(+)，构建二种表达载体pET12a(+)-EGF-IL-18、pET26b(+)-EGF-IL-18，限制性内切酶双酶切和测序鉴定质粒构建是否正确。将二种表达质粒转化E.coliRosetta(DE3)，IPTG诱导其表达，SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。
2.EGF-IL-18融合蛋白包涵体的复性及纯化分离EGF-IL-18融合蛋白包涵体，并用2M尿素和1％。TritonX-100反复洗涤。以8M尿素溶解包涵体，将包涵体裂解液上样于弱阴离子交换柱DEAE-SFF，进行柱上复柱，复性产物进一步用分子筛SephadexG-75纯化。
3.体外实验检测EGF-IL-18融合蛋白的初步生物学活性将纯化的EGF-IL-18融合蛋白复性纯化产物与人外周血单个核细胞(PBMC)共培养24h，ELISA法检测培养上清中IFN-γ的分泌水平来初步评价EGF-IL-18融合蛋白的复性效果和生物学活性。
4.利用发酵技术大量培养工程菌分别运用LB培养基、半合成培养基和合成培养基对工程菌进行发酵培养，并运用BIO-FLO发酵系统对发酵条件经行监控和优化。
结果：
1.原核表达载体的构建和表达双酶切分析以及测序结果表明原核表达载体pET12a(+)-EGF-IL-18、pET26b(+)-EGF-IL-18与设计相符；工程菌E.coliRosetta(DE3)/pET12a(+)-EGF-IL-18诱导表达后在分子量为21kDa处可产生特异的表达条带，并能够被抗人IL-18单克隆抗体所识别。工程菌E.coliRosetta(DE3)/pETl2a(+)-EGF-IL-18诱导表达后在分子量为21kDa处可产生特异的表达条带，并能够被抗人IL-18单克隆抗体所识别，与预期一致。
2.EGF-IL-18融合蛋白包涵体的复性及纯化变性的EGF-IL-18融合蛋白包涵体经阴离子交换层析柱DEAE-SFF柱上复性和凝胶过滤层析SephadexG-75进一步纯化后纯度达95％。
3.体外实验检测EGF-IL-18融合蛋白的初步生物学活性IFN-γELISA结果显示，EGF-IL-18融合蛋白具有明显地诱导KG-1细胞产生IFN-γ的能力，但活性低于标准MetIL-18。
4.利用发酵技术大量培养工程菌通过发酵培养，普通LB培养基发酵可以一次性得到66.6g菌和10.5g包涵体；半合成培养基可以一次性得到198.2g菌和29.4g包涵体；而合成培养基发酵运用补料技术可以一次性得到482g菌和90.5g包涵体。
结论：
本文成功构建原核表达载体pETl2a(+)-EGF-IL-18和pET26b(+)-EGF-IL-18，分离纯化获得了具有天然N端的、有活性的EGF-IL-18融合蛋白，同时建立了一套发酵EGF-IL-18融合蛋白的条件，为进一步研究融合蛋白的体内外生物作用及其工业化生产奠定基础。