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背景与目的:心脏瓣膜疾病在成人心脏疾病中占很大比重,是造成心力衰竭的主要病因之一。慢性主动脉瓣狭窄是临床常见的导致左心室超负荷的疾病,通过主动脉瓣膜置换解除流出道梗阻是典型的卸负荷过程。理论上瓣膜置换术后左心室压力负荷解除,临床症状应改善彻底,但部分患者心功能仍不能有效恢复,症状缓解不明显,甚或有加重趋势,并不能使患者受益。具体原因尚不明确,是否与心肌纤维化程度有关?压力超负荷/卸负荷后心肌重塑决定心功能的恢复。心肌重塑是指在各种机械应力、代谢和遗传的因素作用下产生的以包括心肌细胞肥大、间质纤维化、细胞间基质成分增加和细胞超微结构改变等为特征的病理生理过程。早期心肌肥厚是压力超负荷作用下产生的适应性反应,它主要发生在长期压力超负荷的情况下,心肌总量增加,收缩力增强,是一种有效的代偿方式。然而,这种代偿能力是有限的,当肥大心肌的需氧量得不到满足时,心肌间质纤维化加重,最终导致心肌收缩功能障碍。在真核生物中,KLFs家族是基础转录因子(BTEBP)中的一大类,它们参与早期的胚胎生长发育、细胞分化、组织器官的形成、原癌基因的突变和血管生成等生理病理过程,是真核生物中最大、最重要的一类基础调控因子,这些KLF因子在生物体多种细胞类型中广泛表达,发挥着各自不同的重要作用。既往针对此家族的众多因子有过广泛的研究,例如对KLF5基因敲除大鼠的研究显示该因子在连续注射血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥厚、纤维化反应过程中是必不可少的;而且,在体外培养的心肌成纤维细胞中,KLF5基因直接调控了与组织重塑和伤口愈合有关的血小板起源的生长因子PDGF-A的转录;另外,在心肌成纤维细胞中特异性敲除KLF5基因,减轻了中等强度压力超负荷所致心肌肥厚,是心血管重塑中的一个重要调控因子,在压力超负荷心肌纤维化中起负向调节作用。而KLF15是已发现的17个KLFs家族基础调控因子中的重要一员,它在细胞的生长、分化、凋亡等各个环节中起重要作用。综合以上研究及发现,我们认为心肌重塑导致的超微结构改变是影响心脏功能恢复的主要分子生物学事件,KLF15又是其中重要的关键因子。本课题拟建立有效的动物及细胞模型,在此动物和细胞两个水平上探寻KLF15在心肌肥厚、纤维化中的具体调控机制。研究方法:本课题基于上述问题,采用在体、体外细胞实验相结合的方法进行,主要分为以下四个部分:第一部分:采用野生型雄性sd大鼠,鼠龄3-4周,在非人工通气的条件下,于主动脉瓣上、升主动脉处缩窄,建立了压力超负荷心肌肥厚、纤维化动物模型,并在不同时间段解除缩窄制作卸压力负荷模型;使用心脏彩色多普勒对该动物模型相关指标进行检测,以明确造模效果。第二部分:利用大鼠非人工通气升主动脉缩窄-松解模型,探寻不同时间点超负荷及完全卸压力负荷后心肌病理改变和心肌纤维化转归特征,探讨klf15基因在此过程中的作用,及其与tgf-β、ctgf、mrtf-a间的相互关系,了解klf15基因在压力超负荷所致心肌纤维化的可能机制。第三部分:进行了大鼠心肌成纤维细胞的体外培养,对培养的原代细胞做出了鉴定以及细胞增殖、凋亡情况的观察,并在此基础之上建立了tgf-β促体外培养大鼠心肌成纤维细胞肥大模型,为心肌肥厚、纤维化发生、发展及其转归的进一步具体分子机制研究提供细胞实验平台。第四部分:在体外培养大鼠心肌成纤维细胞基础之上,以所构建的tgf-β促细胞肥大模型为平台,引入干涉和过表达klf15腺病毒载体并转染,从细胞水平上探讨了心肌纤维化及转归中的具体分子机制。研究结果:主要结果如下:1、我们利用sd大鼠在非人工通气的条件下完成了升主动脉的缩窄及松解手术,通过心脏彩色多普勒检测,从彩超图像及相关测定数据结果中了解到:缩窄效果确切,缩窄后升主动脉直径缩小约50%,横截面积缩小约75%,缩窄远端有较明显扩张,缩窄后左室后壁、室间隔厚度增加明显,而心脏射血分数、左室短轴缩短率、左室收缩压明显降低,左室舒张末压明显增加,而缩窄松解后,升主动脉直径、心脏射血分数、左室短轴缩短率、左室收缩压均有所恢复,室壁及室间隔厚度、左室舒张末压均有不同程度降低。2、在大鼠非人工通气升主动脉缩窄及松解动物模型中,主动脉瓣上缩窄后1周,即开始出现左心室肥厚、心肌纤维化,随缩窄时间延长,肥厚纤维化增加,tgf-β、ctgf、mrtf-a等细胞因子的mrna及蛋白表达水平逐渐增加,而klf15因子的mrna及蛋白表达水平却逐渐减少;升主动脉缩窄后松解,心脏的各项指标(包括心室肥厚情况、心肌纤维化程度等)都有所改善,但早期(1W)、中期(3W)、晚期(6W)缩窄后松解组的恢复程度有一定差异,越早去缩窄的,各指标改善更为显著。这说明心脏结构、功能的恢复程度与缩窄的持续时间有关。而TGF-β、CTGF、MRTF-A等细胞因子的mRNA及蛋白表达水平松解后有逐渐减少趋势,KLF15因子的变化则相反,越早去缩窄越能更好的恢复并接近正常。3、通过对所培养的大鼠心肌成纤维细胞形态学观察、免疫荧光鉴定、增殖及凋亡等生物活性检测,我们可知该大鼠心肌成纤维细胞的体外培养方法可靠,操作简便,细胞生长良好,纯度高,可稳定传代;通过对Ⅰ型胶原mRNA水平的检测结果分析,TGF-β确有促心肌成纤维细胞肥大、纤维化的作用,且效果明显。4、所构建的KLF15过表达腺病毒及其干扰片段在体外培养的大鼠心肌成纤维细胞中有较高的转染率,转染效率与作用浓度和时间在一定范围内也呈正相关。过表达KLF15腺病毒与心肌成纤维细胞转染后,KLF15 mRNA和蛋白表达水平显著提高,TGF-β、CTGF、MRTF-A的mRNA和蛋白表达水平明显降低,其细胞肥大、纤维化减轻,Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量减少。而KLF15干扰片段与细胞转染后,上述各指标变化均与之相反。结论:1、成功建立大鼠非人工通气升主动脉缩窄/松解模型,该模型操作简便,重复性好,经济,为今后进行心肌压力超负荷—卸负荷研究提供了良好的动物实验平台;2、在大鼠心肌成纤维细胞体外培养的基础上,成功构建了TGF-β促细胞肥大模型,为心肌肥厚、纤维化发生、发展及其转归的进一步具体分子机制研究提供了良好的技术手段和细胞实验平台;3、KLF15可通过反馈调节TGF-β,抑制CTGF及MRTF-A的作用,减轻心肌间质纤维化及心肌成纤维细胞表型转变,从而改善心功能,在促心肌肥厚、纤维化中起关键的负性调控因子作用。4、KLF15对心肌纤维化作用的可能机制为:在压力超负荷刺激时,心肌成纤维细胞在机械应力或化学因素的作用下,TGF-β表达增加,通过自(旁)分泌的形式作用于成纤维细胞,活化P38MAPK进而抑制KLF15的表达,一方面,低表达的KLF15失去对心肌成纤维细胞CTGF表达的抑制,促进心肌纤维化的发生;另一方面,低表达KLF15对心肌素相关转录因子A(MRTF-A)失去竞争性结合能力,MRTF-A通过SRF促进心肌成纤维细胞分化为肌成纤维细胞,促进间质纤维化。