【摘 要】
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研究背景呼吸道合胞病毒（RSV）是引起婴幼儿和老人呼吸道感染的主要病原体之一,其传染能力强、致死率高,严重危害全球人类的身体健康,然而现有RSV检测方法主要依赖于大型仪器以及专业技术人员,导致检测成本高、处理周期较长。因此,开发一种成本低、易操作的用于日常生活中RSV快速检测的方法有很好的应用前景。研究目的适配体具有更加灵活的空间构象、无免疫原性、成本低等优点,在病毒的快速检测研究中被广泛应用。本
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研究背景呼吸道合胞病毒（RSV）是引起婴幼儿和老人呼吸道感染的主要病原体之一,其传染能力强、致死率高,严重危害全球人类的身体健康,然而现有RSV检测方法主要依赖于大型仪器以及专业技术人员,导致检测成本高、处理周期较长。因此,开发一种成本低、易操作的用于日常生活中RSV快速检测的方法有很好的应用前景。研究目的适配体具有更加灵活的空间构象、无免疫原性、成本低等优点,在病毒的快速检测研究中被广泛应用。本课题拟筛选得到与RSV特异性结合的适配体,并建立一种基于适配体-纳米金比色法检测RSV的可视化方法,为RSV的快速诊断提供新的方法。同时进行环状适配体的研究,增加环状适配体在RSV检测方面的应用,并对RCA扩增产物进行可视化检测方法的研究,为环状适配体的检测提供新的思路。研究方法本文首先选用磁珠-SELEX技术作为RSV体外适配体筛选方法,以RSV作为靶标,BSA作为反筛蛋白,建立筛选流程,并对文库浓度和结合效应进行监控。然后对最后一轮文库进行测序分析,获得候选序列。随后采用点杂交、纳米金比色法、ELISA法对候选适配体的结合力、特异性和亲和力进行表征,同时建立适配体-纳米金比色法对RSV最低检测限进行测定。之后将适配体环化,通过QCM和纳米金比色法评估环状适配体的结合力和亲和性。最后探究鱼精蛋白-纳米金比色法验证基于环的RCA扩增产物的检测方法。研究结果（1）经过14轮的筛选,完成9条RSV候选适配体的测序,序列之间同源性较低且二级结构形状不一。（2）经过对候选适配体的点杂交和纳米金的表征,验证了R1、R3、R7该3条适配体能特异性的识别RSV,并通过ELISA法测得3条适配体的解离常数（Kd值）分别为14.33±4.34 n M、26.45±6.97 n M、3.05±1.63 n M。选用亲和力最好的适配体R7采用纳米金比色法检测RSV的最低检测限为0.1 ng/μL。（3）将适配体R1环化,通过QCM法确定了环状适配体Capt1对RSV同样具有结合效应。采用纳米金比色法测定Capt1的Kd值为97.25±9.87 p M,证明了与线状适配体相比,环状适配体具有更好的亲和力。（4）采用鱼精蛋白-纳米金比色法检测RCA扩增产物,可根据阴性阳性的颜色的差异判断RCA扩增结果,最终确定RCA反应模板中是否含有环状适配体。研究结论本课题初步建立了针对RSV的可视化新型检测方法,即基于适配体的纳米金比色法检测RSV,该方法特异性强、操作简单、实验结果可视化,整个检测过程仅需1.5 h,为RSV的诊断提供了一种新型检测方法。同时进行环状适配体的研究,为设计RSV的生物传感器提供了一种新型的专用探针,有潜在的应用价值。
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