论文部分内容阅读
第一部分 不同代谢状态的肥胖患者血清ZAG水平的变化[研究目的]肥胖作为一种常见疾病,已危害全球人类的健康。与代谢正常型肥胖(metabolically healthy obesity,MHO)相比,代谢异常型肥胖(metabolically abnormal obesity,MAO)患者通常并发症更多,预后更差。锌α2糖蛋白(zinc-alpha 2-glycoprotein,ZAG)是一种新型的脂肪细胞因子。我们前期的研究表明,与体重正常人相比,肥胖患者血清ZAG水平明显降低,并与体重、体重指数(bodymassindex,BMI)、腰围(waistcircumference,WC)、臀围、腰臀比等指标呈负相关。但关于不同代谢状态的肥胖患者中ZAG水平的变化,目前尚无相关文献报道。因此,本研究旨在比较代谢正常、代谢异常和代谢异常合并糖尿病的肥胖患者血清ZAG的水平,并进一步探讨血清ZAG在区别代谢正常和代谢异常肥胖患者中的效能。[研究方法]本研究纳入北京协和医院肥胖门诊肥胖患者193名以及体检中心的受试者32名。根据体重和代谢情况,将受试者分为4组:体重正常代谢正常组(metabolically healthynon-obese,MHNO,n=32)、MHO 组(n=40)、MAO 组(n=104)、代谢异常型肥胖合并 2 型糖尿病组(metabolically abnormal diabetic obese,MADO,n=49)。肥胖、代谢异常、2型糖尿病的定义分别采用中国成人BMI分类标准、美国国家胆固醇教育计划成人治疗小组第3次报告标准(The Adult Treatment Panel Ⅲ of the National Cholesterol Education Program,NCEP/ATPⅢ)、美国糖尿病协会(American Diabetes Association,AD A)的诊断标准。采用酶联免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定血清脂肪因子ZAG和脂联素的水平。用t检验进行两组间计量资料的比较,用方差分析进行多组间计量资料的比较,用卡方检验进行计数资料的比较。用Pearson相关分析ZAG和脂联素与每组患者各参数之间的相关性,用线性回归分析ZAG和脂联素的独立影响因素,用多元logistic回归分析代谢异常的风险因素,用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)判断ZAG和脂联素诊断代谢异常的敏感性和特异性。[研究结果]1、与MHNO组相比,MHO组患者血清ZAG水平代偿性升高(8.44±1.14μg/mL vs.8.02±0.98μg/mL,P<0.05),而随着代谢异常情况的加重,MAO和MADO组血清ZAG的水平依次降低,与MHO组相比,分别降低了 5.81%和10.55%(P<0.05)。血清脂联素在MHNO组和MHO组无明显差异(19.82±6.88μg/mL vs.19.39±6.18μg/mL,P>0.05)。与MHO组相比,MAO组和MADO组脂联素水平分别降低了14.90%和 26.71%(P<0.05)。2、两变量相关分析显示,在所有受试者中,血清ZAG与胆固醇(total cholesterol,TC)呈正相关(r=0.145),而与空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)(r=-0.206),餐后2小时血糖(r=-0.209),口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT)0分钟血糖(r=-0.206),OGTT 120分钟血糖(r=-0.209),稳态模型评估胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin,HOMA-IR)(r=-0.172)和脂联素稳态评估模型(homeostasis model assessment of adiponectin,HOMA-AD)(r=-0.191)呈负相关关系(P均<0.05)。在所有受试者中,血清脂联素与年龄(r=0.179)、性别(r=0.259)、高密度脂蛋白胆固醇(r=0.270)和胰岛素敏感性检测指数(quantitative insulin sensitivity check index,QUICKI)(r=0.375)呈正相关,与 BMI(r=-0.233)、WC(r=-0.317)、收缩压(r=-0.163)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)(r=-0.221)、谷丙转氨酶(r=-0.250)、谷草转氨酶(r=-0.156)、TC(r=-0.164)、甘油三酯(r=-0.224)、低密度脂蛋白胆固醇(r=-0.149)、游离脂肪酸(r=-0.286)、肌酐(r=-0.156)、尿酸(uricacid,UA)(r=-0.314)、FBG(r=-0.162)、空腹胰岛素(r=-0.347)、OGTTO 分钟血糖(r=-0.162)、HOMA-IR(r=-0.351)、脂肪组织胰岛素抵抗(adipose tissue insulin resistance,Adipo-IR)(r=-0.333)和HOMA-AD(r=-0.558)呈负相关关系(P均<0.05)。逐步多元线性回归分析发现,TC(β=0.223),餐后 2 小时血糖(β=-0.201),HOMA-AD(β=-0.155)是血清ZAG水平的独立影响因素(P均<0.05)。年龄(β=0.094)、DBP(β=-0.115)、UA(β=-0.127)、HOMA-IR(β=1.119)、HOMA-AD(β=-1.375)和 QUICKI(β=0.242)是血清脂联素的独立影响因素(P均<0.05)。3、将所有受试者按血清ZAG水平进行三等分(低:<7.582μg/mL;中:7.582-8.283μg/mL;高:≥8.283μg/mL),进一步采用多元logistic回归分析探讨血清ZAG水平与代谢异常风险之间的关系。结果表明,以高ZAG三分位数组为参照(reference=1.00),低ZAG三分位数和中ZAG三分位数组人群代谢异常的发生风险明显增加,其OR值及95%置信区间分别为2.406(1.214-4.768)(P=0.012)和2.985(1.474-6.046)(P=0.002),而且在校正年龄、性别、BMI、血压、血糖、血脂、UA等指标后,该趋势仍存在,表明血清ZAG水平降低是发生代谢异常的危险因素。另外,将所有受试者按血清脂联素水平进行三等分(低:<12.620μg/mL;中:12.620-19.300μg/mL;高:≥19.300μg/mL),采用多元 logistic回归分析探讨血清脂联素水平与代谢异常风险之间的关系。结果表明,低脂联素水平的人群患代谢异常的风险是高脂联素水平人群的5.371倍(95%CI 2.452-11.761,P=0.000);而且在校正年龄、性别、BMI、血压、血糖、血脂、UA等指标后,该趋势仍存在,表明血清脂联素水平降低也是发生代谢异常的危险因素。4、通过ROC曲线分析血清ZAG对代谢异常的诊断价值,其曲线下面积为0.622,95%置信区间为0.539-0.706,诊断的灵敏度为50%,特异性为73.2%。另外,用ROC曲线分析血清ZAG和脂联素联合诊断对代谢异常的诊断价值,其曲线下面积为0.703,95%置信区间为0.629-0.776,诊断的灵敏度为62.7%,特异性为73.6%。并且血清ZAG和脂联素联合诊断代谢异常的价值要高于ZAG单一指标的诊断价值(P<0.05)。[研究结论]1、血清ZAG水平在代谢正常型肥胖患者中会代偿性升高,而在代谢异常型肥胖患者中降低,在代谢异常合并2型糖尿病的肥胖患者中ZAG的水平更低,提示血清ZAG的水平与机体代谢状况密切相关。2、与高血清ZAG水平人群相比,血清ZAG水平降低的患者发生代谢异常的风险明显升高。3、血清ZAG具有一定的区分代谢正常和代谢异常肥胖患者的效能,联合血清脂联素水平区分代谢异常的效能会大一些。第二部分 ZAG过表达/敲减在小鼠肥胖发生过程中/肥胖形成后的作用及其机制的研究[研究目的]ZAG是一种新型的脂肪因子,与肥胖和糖脂代谢的调节密切相关。我们前期的研究结果发现ZAG过表达能明显降低高脂诱导肥胖小鼠的体重、脂肪含量,增加胰岛素的敏感性,但ZAG早期干预是否可以在高脂饮食喂养的小鼠预防肥胖的发生以及ZAG敲减对肥胖小鼠的作用及其机制目前尚不清楚。因此,本研究一方面在动物水平构建了 ZAG过表达和敲减的腺相关病毒8(adeno-associated virus 8,AAV8)载体,通过皮下脂肪组织定点注射,观察(1)ZAG过表达/敲减在小鼠肥胖发生过程中的作用及其可能的作用机制;(2)ZAG过表达/敲减对高脂饮食诱导肥胖小鼠的作用及其可能的作用机制。另一方面在细胞水平观察(1)稳定转染ZAG即ZAG内源性过表达在3T3L1脂肪细胞分化过程中对白色脂肪棕色化相关基因表达的影响;(2)外源性鼠/人ZAG纯品干预对诱导分化成熟的3T3L1脂肪细胞中白色脂肪棕色化相关基因表达的影响。[研究方法]包括动物实验和细胞实验两部分。动物实验主要分为以下4部分:1、ZAG-AAV8 和 ZAG-shRNA-AAV8 病毒载体的构建。首先在 3T3L1/Hepa1-6 细胞上对ZAG过表达质粒pcDNA3.1(-)-mZAG和靶向敲减ZAG的含有ZAG-shRNA序列的质粒进行体外表达验证;然后分别将验证后的过表达/敲减质粒提供给山东维真生物科技公司和上海和元生物科技公司,进行ZAG-AAV8和ZAG-shRNA-AAV8病毒载体的构建和包装。2、ZAG-AAV8干预(ZAG过表达)对高脂喂养小鼠体重等的影响。首先选取8周龄雄性C57BL6/J小鼠12只,随机分为对照组,尾静脉低剂量组、尾静脉中剂量组、尾静脉高剂量组、皮下脂肪低剂量组、皮下脂肪高剂量组,进行ZAG-AAV8注射部位和剂量的摸索。然后选取40只8周龄的雄性C57BL6/J小鼠,随机分为普通饮食对照组(1组,n=10)、高脂饮食对照组(2组,n=10)、高脂饮食ZAG过表达组(3组,n=10)、高脂饮食阳性药组(4组,n=10)。1组、2组双侧及3组小鼠左侧腹股沟皮下脂肪组织均注射100μL(浓度为1*1012vg)对照病毒,3组小鼠右侧腹股沟皮下脂肪组织注射100μL(浓度为1*1012vg)ZAG-AAV8病毒,4组行恩格列净(10mg/kg/d)灌胃给药,从实验干预当天开始,1组给予脂肪含量10%的普通饲料;其余3组给予脂肪含量45%的高脂饲料。4周后,行腹腔注射葡萄糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)和腹腔注射胰岛素耐量试验(intraperitoneal insulin tolerance test,IPITT),7 周后处死小鼠,测量小鼠体重、体脂及血生化指标;用HE染色观察小鼠皮下脂肪细胞的形态;用免疫组织化学染色观察小鼠皮下脂肪组织中ZAG和解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)表达情况;用RT-qPCR的方法检测小鼠附睾脂肪和肝脏中ZAG和糖脂代谢相关基因的表达;另外,采用转录组测序技术(RNA sequencing,RNA-seq),寻找上述1-3组小鼠皮下脂肪组织中差异表达的基因,并利用生物信息学软件,对差异基因进行信号通路和生物学功能等的分析。3、ZAG-shRNA-AAV8干预(ZAG敲减)对高脂喂养小鼠体重等的影响。选取21只8周龄的雄性C57BL6/J小鼠,随机分为对照组(浓度为1*1011vg,n=5)、极低剂量组(浓度为5*109vg,n=4)、低剂量组(浓度为5*1010vg,n=4)、中剂量组(浓度为2.5*1011vg,n=5)、高剂量组(浓度为1*1012vg,n=3)。各组小鼠均进行双侧腹股沟皮下脂肪组织注射,从实验干预当天开始,给予脂肪含量45%的高脂饲料。6周后,行IPGTT和IPITT,7周后处死小鼠,测量小鼠体重、体脂及血生化指标;用免疫组织化学染色观察小鼠皮下脂肪组织中ZAG和UCP1表达情况;用RT-qPCR的方法检测小鼠皮下脂肪、附睾脂肪和肝脏组织中ZAG和糖脂代谢相关基因的表达;采用RNA-seq技术,寻找1组和4组小鼠皮下脂肪组织中差异表达的基因,并利用生物信息学软件,对差异基因进行信号通路和生物学功能等的分析。4、ZAG-AAV8 干预(ZAG 过表达)和 ZAG-shRNA-AAV8 干预(ZAG 敲减)对高脂诱导肥胖小鼠体重等的影响。选取53只8周龄的雄性C57BL6/J小鼠,随机分为普通饮食对照组(n=10)和高脂饮食对照组(n=43)。8周后高脂饮食喂养肥胖小鼠模型建立成功后,再将小鼠分为普通饮食过表达对照组(1组,n=4);高脂饮食过表达对照组(2组,n=11);高脂饮食ZAG过表达组(3组,n=10);普通饮食敲减对照组(4组,n=6);高脂饮食敲减对照组(5组,n=10);高脂饮食ZAG敲减组(6组,n=12)。1组和2组双侧腹股沟皮下脂肪组织均注射100μL过表达对照病毒(浓度为5*1011vg),4组和5组双侧腹股沟皮下脂肪组织均注射100μL敲减对照病毒(浓度为2.5*1011vg),3组小鼠双侧腹股沟皮下脂肪组织注射100μL(浓度为5*1011vg)ZAG-AAV8病毒,6组小鼠双侧腹股沟皮下脂肪组织注射100μL(浓度为2.5*1011vg)ZAG-shRNA-AAV8病毒。7周后,行IPGTT和IPITT,8周后处死小鼠,测量小鼠体重、体脂及血生化指标。细胞实验主要分为以下2部分:1、建立稳转pcDNA3.1-mZAG的3T3L1前脂肪细胞株,观察在脂肪细胞诱导分化过程中ZAG内源性过表达对白色脂肪细胞棕色化相关基因表达的影响。2、将3T3L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞后,用不同浓度的人/鼠ZAG纯品干预,24小时后,观察外源性ZAG干预对分化成熟的3T3L1脂肪细胞白色脂肪棕色化相关基因表达的影响。[研究结果]动物实验的研究结果如下:1、ZAG-AAV8和ZAG-shRNA-AAV8病毒载体的构建。与转染对照质粒即pcDNA3.1(-)组相比,转染pcDNA3.1(-)-mZAG后,3T3L1细胞中ZAG基因的表达明显增加,可达对照组的18.75倍(P<0.05)。将验证后的pcDNA3.1(-)-mZAG质粒提供给山东维真生物科技有限公司,进行ZAG-AAV8过表达腺相关病毒载体的构建和包装,最终公司提供对照病毒的滴度为5.31x1013vg/mL,ZAG-AAV8病毒滴度为5.21x1013vg/mL。另外,上海和元生物科技有限公司设计并构建的靶向ZAG敲减的shRNA1、shRNA2和shRNA3三个载体中,转染含有shRNA3序列GCCAACAAGAAGCTAGCAT的质粒的细胞,与转染对照质粒的细胞相比,3T3L1和Hepa1-6细胞中ZAG基因的mRNA表达明显降低,仅为对照组的34.40%和59.05%(P均<0.05)。进一步蛋白水平的研究也发现,转染ZAG-shRNA3质粒后,3T3L1和Hepa1-6细胞中ZAG蛋白的表达明显降低,仅为对照组的9.78%和43.81%(P均<0.05)。进一步将ZAG-shRNA3序列提供给上海和元生物科技有限公司,进行ZAG-shRNA-AAV8病毒载体的构建和包装,最终公司提供对照病毒的滴度为 1.73x1013vg/mL,ZAG-shRNA-AAV8 病毒滴度为 1.44x1013vg/mL。2、ZAG-AAV8干预(ZAG过表达)对高脂喂养小鼠体重等的影响。与尾静脉注射相比,皮下脂肪注射AAV8的效果更好。ZAG过表达可以降低高脂喂养小鼠的体重,减少皮下、肾周和棕色脂肪组织的重量。对皮下脂肪组织进行HE染色发现,与普通饮食对照组(1组)相比,高脂饮食对照组(2组)小鼠的皮下脂肪细胞体积明显增加,而ZAG-AAV8注射后,与高脂饮食对照组(2组)小鼠,不仅注射处即右侧皮下脂肪细胞体积明显减小,左侧皮下脂肪细胞体积也明显减小。另外,ZAG过表达可以改善高脂喂养小鼠的糖耐量,增加胰岛素的敏感性。IPGTT结果显示,ZAG过表达后,高脂喂养小鼠60分钟、90分钟血糖及60-90分钟曲线下而积均显著低于高脂对照组(P均<0.05);IPITT结果显示,ZAG过表达后,高脂喂养小鼠30分钟血糖及0-30分钟曲线下面积均显著低于高脂对照组(P均<0.05)。血清生化指标的结果发现,ZAG过表达后,高脂喂养小鼠血清游离脂肪酸明显升高,UA水平明显降低(P均<0.05)。免疫组化结果显示,与高脂饮食对照组(2组)小鼠相比,ZAG-AAV8皮下脂肪组织注射后,不仅注射处即右侧皮下脂肪中ZAG和UCP1的表达明显增加,左侧皮下脂肪中ZAG和UCP1的表达也明显增加。ZAG过表达后,高脂喂养小鼠附睾脂肪组织中ZAG的表达明显升高,可达高脂饮食对照组的69.53倍(P<0.05);UCP1的表达有增高的趋势;FAS的表达明显降低,降低到高脂饮食对照组的60.96%(P<0.05)。RNA-seq结果发现,小鼠皮下脂肪中共发现6588个差异表达的基因,这些差异表达的基因富集的信号通路有统计学差异的一共有35个,包括脂肪细胞中脂质分解相关的信号通路、PI3K-Akt信号通路和产热相关信号通路等。3、ZAG-shRNA-AAV8干预(ZAG敲减)对高脂喂养小鼠体重等的影响。ZAG敲减后,高脂喂养小鼠的体重、附睾、肾周和棕色脂肪组织的重量有增加的趋势。另外,ZAG敲减后可以加重高脂喂养小鼠的糖耐量异常和胰岛素抵抗。IPGTT和IPITT结果显示,ZAG敲减后,高脂喂养小鼠0分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟的血糖均较高脂对照组有升高的趋势。免疫组化结果显示,与高脂饮食对照组小鼠相比,ZAG敲减后,小鼠皮下脂肪中ZAG和UCP1的表达明显减少。组织水平的研究发现,ZAG敲减后,高脂喂养小鼠皮下和附睾脂肪组织中ZAG的表达有降低的趋势,分别降低到高脂饮食对照组的40.15%和83.18%。RNA-seq结果发现,ZAG敲减后,小鼠皮下脂肪组织中共发现160个差异表达的基因,这些差异表达的基因富集的信号通路有统计学差异的一共有3个。4、ZAG-AAV8 干预(ZAG 过表达)和 ZAG-shRNA-AAV8 干预(ZAG 敲减)对高脂诱导肥胖小鼠体重等的影响。对高脂饮食喂养肥胖的小鼠,ZAG过表达可以降低高脂喂养小鼠的体重,而ZAG敲减后,肥胖小鼠的体重有增加的趋势。ZAG过表达后,肥胖小鼠皮下、附睾、肾周脂肪组织重量有降低的趋势;而ZAG敲减后,上述脂肪组织重量有增加的趋势。另外,ZAG过表达可以改善肥胖小鼠的糖耐量,增加胰岛素的敏感性。IPGTT结果显示,ZAG过表达后,肥胖小鼠30分钟血糖及0-30分钟、30-60分钟曲线下面积均显著低于高脂对照组;IPITT结果显示,ZAG过表达后,肥胖小鼠30分钟、60分钟血糖及30-60分钟曲线下面积均显著低于高脂对照组(P均<0.05)。而ZAG敲减后,可以加重肥胖小鼠的糖耐量异常和胰岛素抵抗。IPGTT结果显示,ZAG敲减后,肥胖小鼠60分钟血糖及30-60分钟曲线下面积均显著高于高脂对照组;IPITT结果显示,ZAG敲减后,肥胖小鼠0分钟、120分钟血糖及0-30分钟曲线下面积均显著高于高脂对照组(P均<0.05)。血清生化指标的结果发现,ZAG过表达后,肥胖小鼠血清FBG和UA有降低的趋势。而ZAG敲减后,肥胖小鼠血清谷丙转氨酶水平明显升高,游离脂肪酸水平明显降低(P均<0.05)。细胞实验的研究结果如下:1、稳转pcDNA3.1(-)-mZAG后,细胞中UCP1、成纤维细胞生长因子21(fibroblast growthfactor21,FGF21)和白色脂肪棕色化相关基因,如过氧化物酶体增殖激活受体辅激活因子 1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha,PGClα)、细胞死亡诱导的 DEFFA 样效应子 α(celldeath-inducing DFFA-like effector α,CIDEA)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(peroxisome proliferator-activatedreceptorgamma2,PPARγ2)的表达都有增加的趋势,分别可达对照组的2.41 倍、2.40 倍、1.18 倍、1.25 倍和 2.83 倍。2、将3T3L1细胞诱导分化成熟,加入不同浓度0μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL 的小鼠 ZAG 纯品作用 24 小时后,RT-qPCR 和 western blot结果均表明,5μg/mL的小鼠ZAG纯品作用24小时可显著增加诱导分化成熟的3T3L1细胞中白色脂肪棕色化相关基因,如UCP1、CIDEA和FGF21的表达水平(P>均<0.05)。另外,l0μg/mL的人ZAG纯品作用24小时后,诱导分化成熟的3T3L1细胞中UCP1的表达有升高的趋势,但是没有达到统计学差异。[研究结论]1、与尾静脉注射相比,皮下脂肪组织定点注射腺相关病毒载体的效果更好。ZAG-AAV8干预(ZAG过表达)后,小鼠皮下脂肪组织中ZAG的表达显著升高;ZAG-shRNA-AAV8干预(ZAG敲减)后,小鼠皮下脂肪组织中ZAG的表达显著降低。2、在肥胖发生过程中,ZAG过表达可降低高脂喂养小鼠的体重,减少小鼠皮下、肾周和棕色脂肪组织重量,改善高脂喂养小鼠的糖耐量,增加胰岛素的敏感性;而ZAG敲减后,高脂喂养小鼠的体重、附睾、肾周和棕色脂肪组织的重量有增加的趋势。ZAG的上述作用可能是通过激活脂肪细胞中脂质分解、PI3K-Akt和产热相关信号通路来实现。此外,ZAG过表达后,高脂喂养小鼠皮下脂肪组织中UCP1的表达有增高的趋势。细胞水平的研究结果也发现,稳转pcDNA3.1(-)-mZAG质粒的3T3L1前脂肪细胞诱导分化成熟后,细胞中白色脂肪棕色化相关基因的表达明显增加,提示白色脂肪组织棕色化可能是ZAG在肥胖发生过程中发挥作用的重要机制,并且这一作用可能是直接作用。3、在肥胖模型诱导形成后,ZAG过表达可降低肥胖小鼠的体重,减少肥胖小鼠的脂肪含量,改善肥胖小鼠的糖耐量,增加肥胖小鼠的胰岛素敏感性;而ZAG敲减可加重肥胖小鼠的糖耐量异常和胰岛素抵抗。细胞水平的研究结果发现,外源性ZAG纯品干预,可促进诱导分化成熟的3T3L1细胞中白色脂肪组织棕色化相关基因的表达,提示白色脂肪组织棕色化是ZAG重要的作用机制之一,并且这一作用是直接作用。