苹果SSR和SNP标记开发及在遗传图谱构建和品种鉴定中的应用

来源 :湖南农业大学 | 被引量 : 12次 | 上传用户:jingjing0890
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苹果(Malus domestica Borkh.)是全球温带地区广泛种植的重要果树作物之一,在我国果树生产中占有重要地位。苹果商业化种植模式的发展对新品种的栽培性状提出了更高的要求。目前,苹果新品种的培育手段主要有常规杂交、芽变选种、实生选种和诱变育种等。其中,常规杂交育种通过基因重组有望可获得优异的变异类型,是实现苹果种质创新利用的主要途径。然而,苹果属于多年生作物,基因型高度杂合,杂交后代优株率较低,童期长,给育种工作带来诸多困难。随着生物信息学和分子生物学的发展,利用分子标记辅助选择可有效地加速苹果育种进程,而开发有价值的分子标记是苹果分子育种的前提条件之一。本研究首先以公开发表的苹果基因组序列为材料,利用生物信息学手段和方法分析了苹果全基因组微卫星标记的类型及其分布特征,并优化了SSR-PCR反应体系;通过全基因组重测序开发了苹果SNP标记,了解了苹果基因组单核苷酸的变异情况;利用SNP和SSR标记构建了苹果遗传图谱,并利用SSR标记技术对苹果品种(系)进行了分子鉴别,以期今后为苹果重要农艺性状相关基因定位及分子标记辅助育种奠定基础。主要结果如下:(1)利用基于Perl语言平台的MISA软件对苹果基因组SSR进行了筛查,明确了其物理地址、类型及分布频率等情况,用primer3core程序进行SSR引物批量设计。研究发现,在设定的参数下共检测到苹果基因组163,426个微卫星重复序列,平均每隔3,219.79个碱基就有1个重复序列,一至六核苷酸基元重复均能被检出,不等分布在苹果17条染色体上。用正交试验进行了苹果SSR-PCR反应体系的优化,确定了20μL反应体系中引物、Taq聚合酶、Mg2+、dNTP和DNA模板终浓度分别为1.0μmol·L-1、0.01875 U·μL-1、1.50μmol·L-1、0.15μmol·L-1和5.0 ng·μL-1。(2)以‘金冠’基因组为参考序列,分别对‘富士’和‘金冠’进行全基因组重测序。测序采用IlluminaHiseq 2000测序平台,pair-end双端测序,读长为150 bp,插入片段约为500 bp。结果共获得3,183,680个SNP标记,SNP标记密度约为每270 bp有1个多态性SNP标记。SNP标记中转换(A/G,G/A)和颠换(A/C,A/T,G/T,G/C)发生频率存在很大差别,转换发生的频率为66.98%,颠换为33.02%,二者比率为2.03。(3)以‘富士’ב金冠’杂交的F1代122单株为作图群体,选用已开发的SNP,结合SSR标记构建了苹果遗传图谱。用Joinmap 4.0作图时,分群LOD阈值设置为3.0,采用回归算法和Kosambi’s函数计算遗传距离,最终将301个标记位点定位在17个连锁群上,连锁群总长度为3,410.76 cM,标记平均间隔为11.33 cM;各连锁群长度在88.65326.63 cM之间,平均长度为200.63 cM;平均每个连锁群上有17.71个标记。(4)在分析苹果全基因组SSR序列特征的基础上,筛选出多态性较好的8对SSR引物,利用MCID方法进行了苹果品种(系)的分子鉴别,通过对SSR-PCR指纹图谱的分析,有效区分了60个苹果品种(系),并形成了一张可供参考的苹果品种鉴定草图。
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