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目的:近年来的研究表明DNA的异常甲基化与肿瘤的发生发展密切相关,而细胞因子信号传导抑制因子SOCS-1和造血细胞磷酸酶SHP-1已被研究认为是白血病和其他肿瘤中的候选抑癌基因,在白血病细胞中同样存在甲基化现象,而导致其正常表达下调或缺失。本研究通过检测白血病细胞中SOCS-1和SHP-1基因甲基化状态以及甲基化抑制剂处理前后相关基因的甲基化状态和表达水平,以进一步探讨它们在急性白血病发病中的作用机制,为白血病的靶向治疗提供理论基础。
方法:研究对象为80例急性白血病(AL)患者(包括初治缓解及复发),30例正常对照,及白血病细胞株U937和HL60。
1采用半定量逆转录-聚合酶链反应(simi-quantify reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)和荧光实时定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)方法检测AL患者、正常对照的骨髓单个核细胞的SHP-1、SOCS-1mRNA表达状态及表达水平。
2将人白血病细胞株HL60和U937分别培养于含13％灭活小牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的RPMI1640培养液中,置37℃、体积分数为5％的二氧化碳的培养箱中培养,每2-3天传代1次,取对数生长期细胞用于实验。用MTT及AnnexinV/PI法测定经不同浓度甲基化抑制剂5-氮杂脱氧胞苷(5-aza-CdR)干预后的HL60和U937的细胞增殖凋亡情况。
3应用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chainreaction,MSP)检测AL患者,正常对照及不同浓度甲基化抑制5-aza-CdR干预前后的人白血病细胞株HL60和U937细胞SHP-1、SOCS-1的甲基化状态。
结果:
1 SOCS-1mRNA在各组中的表达:正常对照组的阳性表达率为100％(30/30),基因相对表达水平中位数为0.826;初治组的阳性表达率为42％(20/48),基因相对表达水平中位数为0.337,其表达水平明显低于正常对照组(P=0.00＜0.05);缓解组的阳性表达率为92％(24/26),基因相对表达水平中位数为0.765,与正常对照组相比无显著性差异(P=0.89＞0.05);复发组阳性表达率为50％(3/6),基因相对表达水平中位数为0.323,其表达水平明显低于正常对照组(P=0.00＜0.05)。
2 SHP-1mRNA在各组中的表达:SHP-1mRNA正常对照组的阳性表达率为100％(30/30),基因相对表达水平中位数为1.964;初治组的阳性表达率为45％(22/48),基因相对表达水平中位数为0.166,其表达水平明显低于正常对照组(JP=0.00＜0.05);缓解组的阳性表达率为89％(23/26),基因相对表达水平中位数为0.845,同正常对照组相比无显著性差异(P=1.22＞0.05);复发组阳性表达率为50％(3/6),基因相对表达水平中位数为0.255,其表达水平明显低于正常对照组(P=0.00＜0.05)。
3随着5-aza-CdR浓度的增加,白血病细胞HL60、U937存活率呈明显下降趋势,其中10.0和20.0μmol/L组存活率分别为:HL60为62％和40％:U937为60％和36％。固定5-aza-CdR浓度为IC50值,随着作用时间的延长,白血病细胞存活率呈明显下降。
4在处理前,原代细胞SHP-1基因处于完全甲基化状态;在5-aza-CdR处理后,随着药物浓度的递增,SHP-1基因由完全甲基化逐渐变为部分甲基化,在10.0和20.0μmol/L浓度组,SHP-1基因甚至变为未甲基化状态。
5 SOCS-1 DNA甲基化在80例白血病患者中有66例(83％)表达,其中初治组46例(96％),缓解组15例(58％),复发组5例(83％),而在正常对照中未发现SOCS-1基因的CpG岛甲基化。
6 SHP-1 DNA甲基化在80例白血病患者中有57例(71％)表达,其中初治组43例(90％),缓解组10例(38％),复发组4例(67％),在正常对照中未发现SOCS-1基因的CpG岛甲基化。
结论:
1 SOCS-1和SHP-1基因在初治AL患者低表达,缓解后表达升高,复发时再度降低,表明与白血病的预后有关,可作为判断疗效预后的指标之一。
2白血病细胞中存在SOCS-1和SHP-1DNA的高甲基化,而在正常对照中没有,因此甲基化可能是白血病细胞SOCS-1和SHP-1低表达的原因,很可能是白血病发生的一个重要因素。
35-aza-CdR对白血病细胞株HL60和U937的增殖凋亡均有明显抑制作用,并且随着浓度增大及作用时间的延长SOCS-1和SHP-1基因DNA甲基化程度逐渐降低直至消失,呈浓度和时间依赖性。因此,SOCS-1和SHP-1基因的甲基化可作为一个良好的分子诊断标记及可能的治疗靶点。