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深海放线菌是新颖药物先导化合物的重要战略资源，蕴藏着新的生物合成酶。本课题组从一株深海来源的放线菌新属新种Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652的发酵提取物中分离得到了具有抗感染活性的β-咔啉生物碱类化合物海咔碱(marinacarbolines，MCBs)和核苷类抗生素A201A;前者对疟原虫多重耐药株Dd2及敏感株3D7具有显著的抑制作用;后者对G+菌和大多数厌氧的G-菌具显著的抗菌活性。海咔碱的β-咔啉母核蕴含着独特的成环机制，而A201A中呋喃己糖结构单元形成的生化机制尚不明确。因此，本文对海咔碱及其A201A中呋喃己糖结构单元的生物合成进行了研究。 首先考虑海咔碱的结构特点，采用生物信息学分析、在模式菌株S.lividans TK64中异源表达、体内置换突变、同源基因功能分析的策略成功筛选并鉴定了海咔碱的生物合成基因簇，大小约为5.6 kb，包含四个基因，mcbA(编码酰胺键合成酶)，mcbB(编码未知功能蛋白)，mcbC(编码脱羧酶)，和mcbD(编码O-甲基转移酶);其中mcbABC连续同向排布，为主基因簇，mcbD独立存在于主基因簇之外。 采用组合表达的方式将mcbABC，mcbAB和mcbB分别克隆到E.coli BL21中并分析其表达产物。结果表明，携带mcbABC和mcbAB的基因组合均能在E.coli BL21中表达并产生海咔碱;而未知功能基因mcbB在E.coli BL21中单独表达时，产生一个β-咔啉生物碱母核主产物1-酰基-3-羧基-β-咔啉(6)和两个中间体结构衍生物1-酰基-β-咔啉(5)和1-酰基-3-羟基-β-咔啉(8)，证明McbB负责β-咔啉骨架的形成，是一个催化该类母核形成的新颖的Pictet-Spengler酶。 通过喂养氟代前体化合物和同位素标记化合物实验，证实β-咔啉母核6的形成以色氨酸和三酸酸循环途径中的草酰乙酸作为前体，其形成机制包括Pictet-Spengler环化、脱羧和脱氢过程。进一步对MebB进行同源序列分析，对其中42个高度保守的氨基酸进行单点突变并分析产物6的产生，证实Glu97与其活性密切相关，可能是McbB的催化活性中心。 然后采用基于同源基因指导β-咔啉生物碱发掘的策略，从一株放线菌Nocardiopsissynnemataformans DSM44143的基因组序列中找到了海咔碱的同源基因簇，进一步通过放大规模摇瓶发酵和代谢产物分离，从中得到了两个β-咔啉生物碱类化合物nosycarboline A-B(9和10)。 最后采用同位素标记的D-甘露糖喂养实验，证实A201A结构中的鼠李糖和呋喃己糖结构单元均起源于D-甘露糖。通过蛋白表达和体外生化实验证实MtdM是一个3，5差向异构酶，负责GDP-α-D-甘露糖和GDP-L-半乳糖之间的异构;而A201A生物合成基因簇中的另外一个异构酶则负责GDP-L-(吡喃)半乳糖转化成GDP-L-呋喃半乳糖，是自然界中首次发现的GDP-L-吡喃半乳糖-呋喃半乳糖基异构酶。 总之，本论文阐明了海咔碱的生物合成路径，发现并鉴定了一个能在大肠杆菌宿主中形成β-咔啉骨架的新颖的Pictet-Spengler酶及其功能，阐明了其反应活性位点;采用基于同源基因指导化合物发掘的策略从一株放线菌中分离得到两个β-咔啉生物碱类化合物，为β-咔啉生物碱类化合物的活性筛选提供了实体来源;证实了A201A中两个糖基结构单元的生物合成起源，鉴定了一个新颖的GDP-L-吡喃半乳糖-呋喃半乳糖基异构酶的体外生化功能，并阐明了其催化活性氨基酸残基。研究工作为利用基因挖掘手段、利用组合生物合成和合成生物学技术从自然界中挖掘同源系列化合物并构建新的化学实体提供了基因和酶学工具。