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研究背景糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是由糖尿病状态所导致的一种心脏疾病,与高血压、冠心病和心脏瓣膜病的病理改变无关,早期表现为心室顺应性下降和无症状的舒张功能障碍；后期将进一步发展为收缩功能受损和有症状的充血性心力衰竭。心肌病理结构的异常改变主要表现为心肌细胞肥厚、凋亡和心肌间质纤维化,其中心肌间质纤维化是糖尿病心肌病的主要病理特征。糖代谢异常是糖尿病心肌病的关键始动因素,但引起糖尿病心肌病的具体分子机制仍然不明确,因此研究糖尿病心肌病的病理新机制,寻找作用靶点,成为临床治疗中亟待解决的重要问题。高迁移率族蛋白(HMGB1)是一种高度保守的DNA结合蛋白,广泛存在于哺乳动物体内。在核内,HMGB1参与核小体的构建和稳定,调节基因的转录；在核外,HMGB1可由免疫细胞(如单核细胞、巨噬细胞等)在受到刺激活化后主动释放到细胞质或由坏死细胞破裂被动释放至胞外,引起炎症反应和介导相关信号通路的传导。近来发现,除外免疫细胞外,HMGB1也可被某些非免疫细胞主动分泌,如肿瘤细胞、垂体细胞、肠上皮细胞、心肌细胞、脂肪细胞等,参与炎症反应、肿瘤发生、细胞增殖及分化等病理过程。以往研究发现,HMGB1在胞外可通过与晚期糖基化终产物受体(RAGE)、套样受体(TLR2、TLR4)等受体结合,通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径,介导炎症反应以及促进细胞因子活化。近年,越来越多的研究表明,HMGB1在多种心血管疾病的发生与发展中发挥重要作用,包括心肌缺血/再灌损伤、心肌梗死、动脉粥样硬化、肺动脉高压等。目前研究发现,1型糖尿病患者血清中HMGB1水平较健康人群显著增高,提示我们HMGB1可能在糖尿病心肌病的发病过程中起重要作用。因此,本研究利用链脲佐菌素(STZ)诱导小鼠1型糖尿病模型,探讨HMGB1在糖尿病诱导心肌重构中的作用及其机制。研究目的1.研究高糖是否能诱导心肌细胞和成纤维细胞HMGB1的核转位,并进一步分泌至胞外；2.研究心肌组织中HMGB1在糖尿病诱导心肌纤维化中的作用及其机制；3.探讨重组HMGB1蛋白刺激对心肌成纤维细胞增殖、迁移及合成胶原能力的影响。研究方法1.慢病毒shRNA-HMGB1载体构建：设计3对HMGB1基因的shRNA质粒,根据每个序列的干扰效率,选择效率最高的序列构建含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的慢病毒载体。针对HMGB1的干扰序列为5’-GGCTCGTTATGAAAGAGAAAT-3’,同时应用5’-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3’作为阴性对照序列。2.动物模型建立及HMGB1shRNA慢病毒体内转染将8周龄雄性C57BL/6J小鼠(约25-30g)随机分为模型组(60只)和对照组(15只)。模型组小鼠连续5天腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)溶液,剂量为50mg/kg.d。对照组小鼠注射相应体积的0.1mmol/l无菌柠檬酸缓冲液(pH4.5)。建模当天禁食4h,不禁水。STZ注射1周后取尾静脉血测随机血糖,将随机血糖＞16.7mmol/l的小鼠纳入糖尿病模型组。于糖尿病12周末将模型组小鼠随机分为3组：模型组、shHMGB1慢病毒干预组、shN.C慢病毒对照组。小鼠体内慢病毒转染采用心肌注射的局部转染方式,每只小鼠转染病毒量为1×107UT／30μ1,并选择多点注射入左室壁中。病毒转染4周后取材,并于显微镜下观察心肌组织中GFP的阳性率分析病毒转染效率。3.超声心动图检测心功能采用二维、M超、脉冲多普勒和组织多普勒超声成像技术评价小鼠左室功能。4.组织学染色收集各组小鼠心脏,制备石蜡切片,进行H&E、Masson、天狼星红染色,分别显示心脏的大体形态结构和心肌内胶原的含量。应用免疫组织化学染色,观察心肌组织内HMGB1、胶原I、胶原III、转化生长因子β1(TGF-β1)的分布及表达情况。5.细胞培养本实验采用新生1-3天的Wistar乳鼠心脏分离和培养心肌原代细胞和心肌成纤维细胞作为研究对象,以正常糖浓度培养的细胞为对照组,应用不同浓度及不同时间的高糖分别刺激细胞,观察其对细胞的影响。6.激光共聚焦显微镜检测应用细胞免疫荧光法检测细胞中HMGB1和Ki67的分布与表达水平。7.实时定量逆转录PCR提取各组细胞及组织RNA,进行逆转录和实时定量PCR,检测细胞及组织中HMGB1的mRNA表达水平。8.蛋白印迹收集各组细胞及组织,提取蛋白,分别检测HMGB1、乳酸脱氢酶(LDH)、I型胶原、III型胶原、TGF-β1、MMP-2、MMP-9、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38和p-p38等蛋白的表达水平。9.明胶酶谱法采用明胶酶谱法检测心肌成纤维细胞中MMP-2和MMP-9的活性。10.免疫酶联吸附法(ELISA)收集各组细胞上清,检测细胞HMGB1的分泌水平。11.细胞的增殖和迁移实验采用细胞计数试剂盒CCK8检测心肌成纤维细胞的增殖情况。利用Transwell小室观察成纤维细胞在不同刺激下的迁移情况。12.碘化丙啶染色检测利用Annexin V/PI试剂盒检测细胞坏死的情况。13.统计学分析应用SPSS18.0软件分析处理数据,并以均数±标准差(Mean±SD)表示。研究结果1.高血糖促进小鼠心肌组织HMGB1表达并向组织间隙分泌糖尿病小鼠心肌组织与正常小鼠相比,HMGB1蛋白和mRNA表达水平明显升高,且能观察到HMGB1由胞核向组织间隙分泌。而在正常小鼠心肌组织中,HMGB1的表达主要分布于细胞核中,未见明显的移位。2.抑制HMGB1改善糖尿病引起的左室重构及心功能异常HMGB1’慢病毒干扰shRNA转染小鼠心肌组织4周后,观察各组小鼠心脏左室重构的情况。与正常小鼠相比,糖尿病小鼠心脏形态明显增大、心尖变圆钝。与糖尿病模型组小鼠相比,抑制HMGB1能够明显改善糖尿病引起的心肌结构及形态的改变,降低了心脏重量(HW)和心身重量之比(HW/BW),减小了心肌细胞的体积,但对小鼠体重没有明显影响。STZ注射16周后,糖尿病小鼠心功能损害主要为舒张功能异常,表现为E/A、 E’/A’的降低,左室后壁舒张期增厚；同时伴有收缩功能障碍,表现为EF、FS值减低。抑制HMGB1能够显著改善糖尿病所引起的心功能舒张和收缩异常。3.抑制HMGB1明显减轻糖尿病小鼠心肌纤维化程度Masson染色和天狼猩红染色显示糖尿病小鼠心肌间质纤维化程度较正常小鼠明显增加；免疫组织化学和western blot检测显示心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1蛋白表达水平显著增高。与模型组和慢病毒干预对照组相比,抑制HMGB1明显降低心肌组织胶原沉积以及胶原Ⅰ、Ⅲ和促纤维化因子TGF-β1的水平。4.高糖刺激能增加原代心肌细胞和心肌成纤维细胞中HMGB1的表达及分泌应用不同浓度的高糖(15mM,20mM,25mM)分别刺激原代心肌细胞和心肌成纤维细胞48h后,与对照组(普通培养)相比,培养基上清液中HMGB1含量呈浓度依赖性明显升高,且细胞未发生坏死。细胞免疫荧光染色显示,对照组HMGB1主要定位于细胞核,而高糖刺激48h后,HMGB1由细胞核向细胞浆移位。同时测定HMGB1mRNA表达水平,显示高糖刺激心肌细胞和心肌成纤维细胞8h后,HMGB1mRNA水平开始增加,并于24h达高峰。5. HMGB1能增强心肌成纤维细胞的胶原合成、增殖及迁移能力分别用不同浓度的重组HMGB1蛋白(50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml)刺激心肌成纤维细胞48h,与正常对照组相比,rHMGB1能够显著增加细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1蛋白的表达量。与对照组相比,应用rHMGB1刺激心肌成纤维细胞后,细胞增殖能力明显增强,核增殖相关抗原Ki67阳性率明显增加。此外,应用rHMGB1刺激心肌成纤维细胞24h能明显增强细胞的迁移能力。在高糖刺激条件下,通过中和抗体或基因沉默方式抑制HMGB1后,心肌成纤维细胞合成胶原及增殖能力明显下降。6.抑制HMGB1能减少心肌成纤维细胞中MMP-2、MMP-9的表达与活性高糖刺激心肌成纤维细胞后,western blot检测发现MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平明显增高；而通过中和抗体或基因沉默抑制HMGB1后,心肌成纤维细胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平降低。应用明胶酶谱法检测发现,高糖刺激可以增加细胞中MMP-2的活性,抑制HMGB1后MMP-2的活性显著降低,但在该实验中未能检测出MMP-9的活性。此外,应用rHMGB1蛋白刺激心肌成纤维细胞亦能增加细胞中MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平及MMP-2的活性。7. HMGB1能促进心肌成纤维细胞中ERK、JNK和Akt的磷酸化水平rHMGB1刺激能明显增加心肌成纤维细胞内ERK、JNK和Akt的磷酸化水平。通过中和抗体或基因沉默方式抑制HMGB1后,能够显著降低高糖刺激后心肌成纤维细胞内ERK、JNK和Akt的磷酸化水平。而各组间p38的磷酸化水平无明显差异。同时,在糖尿病小鼠中,抑制HMGB1也能降低心肌组织中ERK和JNK的磷酸化水平。该实验结果提示ERK和JNK的激活参与了HMGB1介导的糖尿病心肌病。研究结论1.高糖促进小鼠心脏组织中HMGB1表达增加,且向胞外分泌；2.下调心肌组织中HMGB1表达可改善糖尿病小鼠心肌重构、心肌纤维化及心功能障碍；3.下调HMGB1减轻糖尿病心肌病的机制可能与抑制ERK和JNK磷酸化有关。研究背景糖尿病是一种由多种因素引起的以慢性高血糖为特征的全身代谢性疾病,可导致机体多种脏器损害,其中心血管疾病是其最主要的死因。糖尿病的发病率在全世界急剧上升,已成为威胁人类健康最主要的慢性疾病之一。心力衰竭在糖尿病患者中发生的比例是非糖尿病患者的2～3倍,将其中发生不依赖于高血压、冠心病及瓣膜性心脏病等疾病的心衰称为糖尿病心肌病。糖尿病心肌病的主要病理改变表现为心肌细胞肥大、凋亡及间质纤维化,整个病程过程中伴随着心肌重构的发生。细胞凋亡是由基因调控的细胞程序性死亡,心肌细胞凋亡在糖尿病心肌病的发生发展中起着关键性作用,心肌细胞数目改变与心室重构和心脏功能密切相关。研究发现糖尿病患者早期即可出现心肌细胞凋亡,但糖尿病诱导心肌细胞凋亡的机制仍不明确。高迁移率族蛋白1(HMGB1)是调控基因转录和维持核小体稳定的非染色体核蛋白,它可被活化的免疫细胞或坏死细胞由细胞核释放到胞外,发挥致炎作用。HMGB1可通过与TLRs及RAGE受体激活MAPK信号通路介导炎症因子产生和细胞凋亡,导致炎性反应及组织损伤。以往研究发现,抑制HMGB1可减轻化疗药物引起的心肌细胞凋亡。我们前期实验研究发现,高糖可刺激心肌细胞主动分泌HMGB1,并参与糖尿病心肌病心肌纤维化的发生。基于以上研究结果,提示HMGB1可能参与了高糖诱导的心肌细胞凋亡过程,并促进糖尿病心肌病的发生与发展。研究目的1.研究HMGB1对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响；2.探讨HMGB1介导高糖环境下心肌细胞凋亡的信号分子机制。研究方法1.细胞培养及模型建立：本实验采用新生的Wistar乳鼠心脏分离和培养心肌原代细胞,应用正常糖浓度(5.5mM) DMEM培养大乳鼠原代心肌细胞,用高糖(33mM) DMEM刺激细胞；以5.5mM葡糖糖+27.5mM甘露醇作为高渗对照。2.基因表达的干预：体外实验,采用慢病毒转染HMGB1shRNA的方式抑制HMGB1的基因表达；应用瞬时转染Ets-1siRNA的方式抑制Ets-1的基因表达。3.激光共聚焦显微镜：采用细胞免疫荧光染色法检测原代心肌细胞内p-Ets-1的含量及分布。4.TUNEL检测凋亡：检测各刺激组心肌细胞及组织的凋亡水平。5.蛋白印迹(western blot analysis):收集各组细胞及组织,提取蛋白,分别检测HMGB1、caspase-3、Bcl-2、Bax、 Ets-1、p-Ets-1、ERK、p-ERK蛋白水平。6.实时定量逆转录PCR (Real-time RT-PCR):收集各组细胞,提取RNA,进行逆转录和实时定量PCR,检测HMGB1的mRNA表达水平。7.糖尿病动物模型建立及HMGB1shRNA慢病毒体内转染：模型组小鼠采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立1型糖尿病模型。1周后测量血糖,将随机血糖＞16.7mmol/l的小鼠纳入实验模型组。在8周末将模型组小鼠随机分为3组：模型组(15只)、shHMGB1漫病毒干预组(15只)、shN.C慢病毒对照组(15只)。小鼠体内慢病毒转染采用心肌注射的局部转染方法,选择多点注射入左室壁中。病毒转染4周后取材。8.组织学检测：应用免疫组织化学染色,观察心肌组织内p-Ets-1的蛋白表达水平。9.统计学分析：应用SPSS18.0软件分析处理数据,并以均数±标准差表示。研究结果1.抑制HMGB1能够减少高糖诱导的心肌细胞凋亡应用慢病毒HMGB1shRNA转染心肌细胞,检测各组心肌细胞的凋亡情况。结果显示,与正常对照组和高渗对照组相比,高糖能够增加细胞的凋亡水平；抑制HMGB1能够降低高糖诱导增加的cleaved caspase-3、Bax/Bcl-2水平及细胞凋亡率。2. HMGB1介导高糖诱导的Ets-1活化在体外实验中,我们进一步研究了高糖增加细胞凋亡的可能机制。应用高糖刺激心肌细胞6h、8h、12h、24h, western blot结果显示,Ets-1的表达在6h较正常对照有所增加,其余时间点Ets-1水平均无明显变化；与正常对照组相比,Ets-1磷酸化(p-Ets-1)水平在6h、8h、12h和24h均明显升高；细胞免疫荧光检测结果发现,高糖刺激主要增加细胞核中p-Ets-1的表达。高糖刺激心肌细胞也能够增加细胞核中p-Ets-1水平；而抑制HMGB1可降低高糖诱导增加的Ets-1磷酸化水平。3.抑制Ets-1能减少高糖诱导的心肌细胞凋亡应用Ets-1siRNA转染心肌细胞抑制Ets-1基因表达,检测Ets-1对细胞凋亡的影响。Western blot及TUNEL检测结果显示,高糖能增加心肌细胞凋亡,而抑制Ets-1可降低高糖刺激增加的cleaved caspase-3、Bax/Bcl-2水平及细胞凋亡率。4. HMGB1通过磷酸化ERK促进Ets-1的活化高糖刺激心肌细胞能促进ERK磷酸化,在60min时效果最显著。抑制HMGB1能够降低高糖诱导的ERK磷酸化。为进一步研究ERK磷酸化在高糖诱导Ets-1活化中的作用,我们应用U0126抑制ERK磷酸化,western blot及细胞免疫荧光染色检测结果发现,抑制ERK磷酸化能降低高糖诱导的Ets-1活化。5.抑制HMGB1能够减少糖尿病小鼠心肌细胞凋亡心肌组织western blot及TUNEL检测结果显示,糖尿病小鼠心肌组织中cleave caspase-3、Bax/Bcl-2及细胞凋亡数目较正常小鼠明显增加；然而,与模型组和慢病毒干预对照组相比,抑制]3MGB1明显降低糖尿病心肌组织中cleave caspase-3、Bax/Bcl-2及细胞凋亡数目。6.抑制HMGB1能够抑制糖尿病小鼠心肌组织中ERK及Ets-1的磷酸化水平Western blot检测心肌中p-ERK及t-ERK水平,结果显示抑制HMGB1能够显著降低糖尿病小鼠心肌组织中ERK磷酸化水平；免疫组织化学检测心肌中p-Ets-1水平发现,抑制HMGB1能够降低糖尿病小鼠心肌组织中Ets-1的活化。研究结论1.抑制HMGB1能够减少高糖诱导的心肌细胞凋亡；2.抑制HMGB1减少心肌细胞凋亡的作用是通过阻断ERK/Ets-1信号通路实现的。