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细胞凋亡又称“程序性细胞死亡(Programmed Cell Death,PCD)”,是细胞的一种生理性、主动性的“自觉自杀行为”。正常的生命需要细胞分裂以产生新细胞,并且也要有细胞的死亡,由此人体和生物的器官才得以维持平衡。所以,细胞凋亡成为多细胞生物更新正常细胞,清除衰老细胞和异常细胞的重要手段。当细胞凋亡过少时,此时该死亡的细胞没有死亡,就可能导致细胞恶性增长,形成肿瘤。
癌细胞的凋亡是一个高度复杂的过程,它包含了多条信号转导通路,而肿瘤抑制因子p53则是众多信号通路的核心中枢。PUMA(p53上调的凋亡因子)是一个Bcl-2家族的BH3-only蛋白,它最初是作为p53的直接靶向基因被鉴定出来。而作为p53的重要下游因子,PUMA(p53上调的凋亡因子)在癌细胞凋亡的过程中发挥了重要的作用。但是PUMA介导凋亡的功能机制及其转录调控机制都存在很大的争议。在本文中,我们利用活细胞实时检测技术,荧光共振能量转移技术(FRET)并结合传统的生物学技术,在多种癌细胞系中研究了p53,PUMA,Bax,Bcl-XL,Akt以及FOXO3a等凋亡调控蛋白之间的相互作用关系,并对PUMA的功能机制和转录调控机制进行了初步的阐述。主要研究结果如下:
1.在DNA损伤试剂紫外辐射的诱导下,PUMA与Bax之间的相互作用逐渐增强,并伴随有Bax由胞浆到线粒体的转位,该结果证明了PUMA通过与Bax发生直接的相互作用而将其激活。与此同时,紫外辐射对细胞的处理还导致了PUMA与Bcl-XL之间的相互作用显著增强,而Bcl-XL与Bax之间的相互作用则明显减弱,该结果证明了PUMA通过竞争结合Bcl-XL而释放了原来被绑定的Bax,从而间接地促进了Bax的转位。上述实验结果不仅通过FRET技术在完整的活细胞内得到证明,并且利用免疫共沉淀等传统生物学技术进行了进一步的验证。此外,p53抑制剂(Pifithrin-α)和蛋白合成抑制剂(CHX)有效的抑制了PUMA介导的Bax转位和细胞凋亡。
2.接下来,我们建立了非DNA损伤试剂十字孢碱(STS)诱导癌细胞凋亡的模型,用于研究除了p53以外,PUMA是否还受其他转录因子的调控。结果显示,STS处理细胞后,PI3K/Akt信号通路被抑制,FOXO3a从Akt的绑定中被释放出来,即被激活。激活的FOXO3a由细胞质转位到细胞核,结合到PUMA的启动子区域并上调了它的表达水平,随后PUMA便引发了Bax由胞浆到线粒体的转位。另外,干扰内源FOXO3a蛋白的表达能显著地抑制STS诱导的Bax转位,而抑制p53的转录活性对这个过程则几乎没有影响。有趣的是,作为FOXO3a经典的下游因子,Bim对STS处理后FOXO3a介导的凋亡几乎没有贡献。
总之,我们的研究首次证明了PUMA可以通过直接与:Bax发生相互作用和竞争结合Bcl-XL两种方式激活Bax,并促进它由胞浆到线粒体的转位；另外,FOXO3a通过上调PUMA的蛋白表达水平介导了STS引发的Bax转位和细胞凋亡,而这个过程与p53和Bim是无关的。本文的研究初步阐明了PUMA在癌细胞凋亡中的功能机制和转录调控机制,对人们了解癌细胞凋亡的过程和具体的分子机制有着非常积极的意义,同时也为癌症的治疗提供了一些潜在的靶点。