论文部分内容阅读
本论文以蛹虫草为材料,设计了3种蛹虫草多糖提取物对诱导肿腺癌A549细胞凋亡的影响,筛选出作用效果最佳的一种多糖提取物进一步检测其凋亡并研究其作用机制。这将丰富食药用真菌多糖类在抗癌活性方面的研究,为蛹虫草多糖抗肿瘤的研究提供理论基础,为开发新的抗癌药物提供实验依据。具体研究方法及结果如下:
1.本实验通过浓缩、离心、脱脂、脱蛋白、醇沉、脱色、透析等一系列工艺手段,从蛹虫草菌丝体深层发酵的发酵液中获得蛹虫草胞外多糖提取物(EPCM),从菌丝体中获得蛹虫草菌丝体多糖提取物(MPCM),从子实体中获得蛹虫草子实体多糖提取物(FPCM)。并测得EPCM中总糖含量为64.03％,还原糖含量为3.81％,蛋白含量为0.76％；MPCM中总糖含量为37.70％,还原糖含量为6.06％,蛋白含量为0.76％；FPCM中总糖含量为54.99％,还原糖含量为4.41％,蛋白含量为0.51％。
2.本论文设计了正交试验研究蛹虫草菌丝体多糖热水浸提的最佳条件,并以此为基础比较了热水浸提法、冷热交替浸提法、盐酸酸浸提法、氢氧化钠碱浸提法对蛹虫草菌丝体多糖提取率的影响。结果表明,热水浸提正交实验最佳配方为:提取温度75℃,提取次数2次,提取时间2.5h,料液比为1:40(g:mL)。不同提取方法对蛹虫草菌丝体多糖提取率的影响为:冷热交替浸提法最高,多糖提取率为159.24 mg·g-1(P<0.01)；热水浸提法次之,多糖提取率为147.38mg·g-1(P<0.01),但两者间并无显著性差异(P>0.05)；盐酸浸提法较低,多糖提取率为99.31 mg·g-1(P<0.01);氢氧化钠浸提法最低,多糖提取率为63.10 mg·g-1(P<0.01)。
3.本论文采用MTT法、HE染色法、Annexin-V-PI复染法研究了EPCM、MPCM、FPCM诱导A549细胞凋亡的作用效果。结果显示三种多糖提取物均能一定的抑制A549细胞增殖及诱导细胞凋亡,且呈时间和剂量依赖性。但三者间作用效果差异显著,其中EPCM作用效果最佳,作用A549细胞12h后,凋亡率为18.38％(P<0.01)。EPCM、MPCM对A549细胞的IC50分别为7.848mg/ml、18.603mg/ml。
4.本论文采用AO/EB荧光染色法、细胞流式仪检测技术、Caspase-3,8,9酶活性检测及Caspase-8抑制剂作用检测进一步研究了EPCM诱导A549细胞凋亡及其作用机制。实验结果表明:①EPCM诱导A549细胞凋亡呈时间和剂量依赖性。②EPCM通过将A549细胞阻滞于S期和G1期两个时期调控细胞周期变化,从而抑制细胞增殖,进一步诱导细胞凋亡。③EPCM诱导A549细胞凋亡过程中激活了Caspase-8,但并未激活Caspase-3,9,且Caspase-8激活的下游执行Caspase可能为Caspase-6,7。其作用机制可能与信号转导途径中的死亡受体途径相关联。