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目的：本研究旨在利用基因工程方法,构建高特异性钠通道阻滞剂μ-芋螺毒素KⅢA原核表达质粒,诱导表达芋螺毒素(CTX)和硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)的融合蛋白,经纯化制备高纯度融合蛋白,为进一步获得目的小肽并研究其生物学活性打下基础。
方法：人工合成含μ-KⅢA基因的序列,5端添加Kpn I酶切位点和肠激酶识别序列,3端添加TAA终止密码子及EcoR I酶切位点,定向克隆到质粒载体pET-32a(+)构建重组融合表达载体pET-32a(+),经过酶切和测序鉴定后,转化大肠杆菌Origami2(DE3);用IPTG诱导表达融合蛋白,经Western blotting验证Trx/CTX融合蛋白,对诱导表达的变量(初始菌浓度、诱导剂浓度、诱导时间)进行优化,SDS-PAGE分析表达情况；经金属螯合亲和层析、凝胶过滤分离纯化融合蛋白Trx/CTX;采用经典的福尔马林实验验证融合蛋白的活性。
结果：重组表达载体pET-32a(+)-KⅢA经酶切和测序分析,证实构建正确；μ-KⅢA在Origami2(DE3)中以可溶的融合蛋白形式高效表达；融合蛋白在IPTG浓度为0.1 mmol/L,初始菌浓度为OD600=1.0,16℃表达20 h可获得最大表达量；纯化后获得蛋白质纯度达90％以上；在小鼠福尔马林实验中,腹腔注射8 mg/kg融合蛋白产生明显的镇痛作用。
结论：成功的构建了原核表达载体pET-32a(+)-KⅢA;在最佳诱导条件下,μ-KⅢA以可溶性融合蛋白形式高效表达；得到了高纯度的Trx/CTX融合蛋白；福尔马林实验验证融合蛋白具有镇痛作用。本实验为进一步研究获得小肽μ-KⅢA奠定基础。