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研究背景卵巢癌是全球范围内最常见的妇科恶性肿瘤之一,据2015年统计,我国每年约有5.21万名新诊断的患者,其中上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)最为常见。EOC的主要治疗方法是手术切除病灶组织,然后以诸如:化疗、放疗以及维持治疗等辅助后续治疗手段防止复发。尽管临床治疗上有一定发展,但治疗的结果仍然不容乐观。因此,寻找能够揭示EOC发生的深层分子机制成为诊断和治疗EOC的迫切需要。长链非编码RNA(Long noncoding RNAs,lncRNAs)是非编码RNA家族中的重要成员,与microRNA(长度20-22 nt)和环状RNA(共价闭环)共同存在,lncRNA的核苷酸序列长度超过200个核苷酸。研究发现,lncRNA在人类恶性肿瘤的发生发展中发挥着越来越重要的作用。例如,与邻近组织和细胞相比,lncRNA LINC00460在EOC组织和细胞中表达上调,同时,lncRNA LINC00460通过结合miR-338-3p在EOC中发挥致癌作用。LncRNA CASC2在EOC组织和细胞中表达下调,其下调提示着EOC患者的不良预后。这些研究均提示了lncRNA可能成为EOC诊断和治疗的新型分子靶点。有多项研究报道lncRNA TP73-AS1在人类多种癌症组织和细胞中均有表达,如骨肉瘤、膀胱癌和肾透明细胞癌。然而,lncRNATP73-AS1在EOC中的研究仍没有被报道,因此我们想探讨EOC中lncRNATP73-AS1的表达模式、生物效应和作用机制。研究目的我们计划在EOC组织和细胞中,探讨lncRNATP73-AS1的表达模式,并且深入探讨其作用机制,观察lncRNA TP73-AS1对表观遗传学的影响。首先我们对lncRNATP73-AS1与EOC的临床相关性进行研究,分析TP73-AS1在EOC组织和EOC细胞系中的表达模式,并对TCGA数据库中TP73-AS1表达数据的预后相关性进行分析;进一步,我们以EOC细胞系为研究载体,观察TP73-AS1在EOC癌细胞系上的功能,分别通过敲低和过表达TP73-AS1水平,观察TP73-AS1对EOC癌细胞系增殖、凋亡和侵袭的影响,并且在体内水平上观察TP73-AS1敲低对裸鼠EOC肿瘤生长的影响;最后,我们着重对TP73-AS1在EOC中的作用机制进行研究,分析TP73-AS1在EOC癌细胞系中的细胞内表达定位,然后从表观遗传角度分析受lncRNA TP73-AS1影响的下游分子,以及细胞核内组蛋白修饰酶的表达变化,同时通过阻断下游分子表达从而进一步明确下游相关分子在TP73-AS1影响的下游信号通路中的作用。研究方法本研究分为三个部分:1.LncRNATP73-AS1与EOC临床相关数据收集与分析:1.1.收集来自山东大学附属山东省立医院妇科收治的28例卵巢癌患者样品,28例患者均经三位临床病理专家会诊被确诊为EOC。研究中收集的信息和样品均获得所有患者的书面知情同意并同时获取了山东大学附属山东省立医院伦理委员会的批准。1.2.采用荧光定量PCR检测EOC癌组织和癌旁组织中lncRNATP73-AS1的表达水平。规范培养SKOV3、CAOV3、HO8910和OV420多种上皮性卵巢癌细胞系,以及正常人类卵巢上皮细胞系HOSEPiC;收集细胞,提取总RNA,采用荧光定量PCR检测不同细胞系的lncRNA TP73-AS1表达水平。1.3.在 TCGA 数据库网站(http://cancergenome.nih.gov/)收集 lncRNATP73-AS1表达水平和患者的预后信息,制作生存曲线,比较TP73-AS1高表达组和低表达组的生存率。2.LncRNATP73-AS1的生物效应研究:2.1.设计合成三条lncRNA TP73-AS1的siRNA,并且构建过表达TP73-AS1的pcDNA3.1-TP73-AS1 质粒。2.2.TP73-AS1在EOC中的功能研究:使用RNAi MAX将siRNA转染到SKOV3细胞中实现对 lncRNA TP73-AS1 的敲低;使用 lipofectamine 3000 将 pcDNA3.1-TP73-AS1质粒转染到CAOV3细胞中,进行TP73-AS1在CAOV3中的过表达。之后收集细胞,采用荧光定量PCR检测lncRNATP73-AS1表达水平,选择最优的TP73-AS1的敲低序列。将最有效的TP73-AS1的siRNA转染到SKOV3细胞中,将pcDNA-TP73-AS1质粒转染到CAOV3细胞中,分别用Transwell法检测细胞侵袭能力,用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色和流式细胞仪检测细胞凋亡比率,同时用CCK-8法检测细胞增殖能力。进一步构建含最优siRNA序列的TP73-AS1的慢病毒表达载体,感染细胞获得病毒后,将病毒感染到SKOV3细胞中,再经药物筛选获得稳定敲低TP73-AS1的SKOV3稳定细胞系;收集特定数量活细胞,将其注射到裸鼠皮下,每3日检测肿瘤大小,并于21日时处死小鼠,剥离肿瘤,对肿瘤进行称重并比较TP73-AS1敲低组和对照组肿瘤的重量和大小。3.TP73-AS1在EOC中的机制研究:3.1.用荧光定量PCR检测SKOV3细胞核和细胞质中lncRNA TP73-AS1的水平差异,用荧光原位杂交方法检测lncRNATP73-AS1在细胞中的亚细胞定位。3.2.在SKOV3细胞中敲低TP73-AS1,采用荧光定量PCR检测CKIs(细胞周期素依赖蛋白激酶抑制蛋白)家族和CDKs(周期蛋白依赖性激酶)家族各成员的mRNA表达,并用免疫印迹法验证相关因子是否随同TP73-AS1敲低而变化;为了进一步探讨TP73-AS1对细胞周期相关因子的调节机制,我们之后采用RNA结合蛋白免疫沉淀法(RIP)检测与TP73-AS1结合的组蛋白修饰酶;采用染色质免疫共沉淀法(ChIP)检测EZH2和H3K27me3在p21基因启动子区的结合情况;随后,我们将TP73-AS1和p21的siRNA共同转染到SKOV3细胞中,收集细胞后,分别用Transwell法检测细胞侵袭,用碘化丙啶染色和流式细胞仪检测细胞凋亡比率,用CCK-8法检测细胞增殖情况。最后,我们通过收集和分析TCGA数据库中TP73-AS1、p21和EZH2表达水平和患者预后数据,制作p21和EZH2生存曲线,比较TP73-AS1和EZH2表达的相关性。研究结果1.与EOC癌旁组织相比,TP73-AS1在EOC癌组织标本中表达明显上调;与之一致的是,在 SKOV3、CAOV3、HO8910、OV420 几种 EOC 细胞系中 TP73-AS1表达水平也明显高于正常人卵巢上皮细胞系HOSEPiC的TP73-AS1水平;另外,TCGA数据库的Kaplan-Meier生存曲线分析结果提示:EOC患者TP73-AS1 mRNA表达水平越高,预后越差。2.为了探讨TP73-AS1对EOC细胞生物学功能的影响,我们发现TP73-AS1 siRNA下调SKOV3细胞的TP73-AS1水平,TP73-AS1过表达质粒上调CAOV3细胞的TP73-AS1水平。Transwell侵袭实验表明,TP73-AS1的敲低导致TP73-AS1侵袭细胞的数量减少,而过表达TP73-AS1则引起侵袭细胞数量明显增加;凋亡实验结果表明,TP73-AS1的敲低能促进EOC细胞凋亡,而过表达TP73-AS1会抑制EOC细胞凋亡;另外,CCK-8实验表明,TP73-AS1的敲低抑制EOC细胞增殖,而过表达TP73-AS1则促进细胞增殖。体内裸鼠成瘤实验发现,与SKOV3阴性对照组相比,TP73-AS1敲低组肿瘤的生长受到明显抑制。3.通过探索TP73-AS1在细胞内的亚定位,我们发现,TP73-AS1主要表达于细胞核中,提示TP73-AS1在EOC细胞中的机制可能是影响基因的转录调控;进一步证实,TP73-AS1敲低显著升高p21的mRNA和蛋白水平,不影响其它CKIs和CDKs的mRNA水平。使用RIP实验,证实TP73-AS1与EZH2蛋白和H3K27me3有较强的结合作用,ChIP实验也表明,EZH2蛋白和H3K27me3能结合到p21基因的启动子区上,而敲低TP73-AS1后,EZH2蛋白和H3K27me3同p21基因启动子的结合能力明显降低。TCGA数据库的Kaplan-Meier生存曲线分析,EZH2高表达的EOC患者预后较差,p21高表达的EOC患者预后较好,且EZH2表达水平同TP73-AS1水平呈现正相关的关系。以上结果均提示:TP73-AS1可能通过与EZH2结合,影响EZH2和H3K27me3在p21启动子区的结合情况从而抑制p21基因的转录。4.当在SKOV3细胞中敲低TP73-AS1时,造成细胞增殖和侵袭能力减弱及凋亡细胞增加;当在敲低TP73-AS1的同时再敲低p21时,随着p21mRNA和蛋白的减少,上述进程发生回补,造成细胞增殖和侵袭能力回补,细胞凋亡下调。以上结果提示:TP73-AS1能通过靶向p21调控EOC细胞的恶性进程。研究结论1.本研究发现TP73-AS1在EOC癌组织和细胞中表达均显著上调,高表达水平的TP73-AS1是导致EOC患者临床不良预后的原因之一,这提示TP73-AS1是EOC的致癌基因之一。2.机制研究结果显示,在EOC细胞中,TP73-AS1通过影响EZH2和H3K27me3与p21启动子区的结合,在表观遗传水平上抑制p21的转录水平。3.TP73-AS1通过表观遗传沉默p21表达,促进上皮性卵巢癌细胞的增殖、侵袭能力和抑制细胞的凋亡,影响EOC的进程。