论文部分内容阅读
研究目的 E3泛素连接酶在蛋白的泛素蛋白酶体降解过程中起重要作用，但是目前有很多E3的泛素连接酶的底物和功能不是很明确。近来研究发现E3泛素连接酶能在自噬等细胞的重要生物学过程中起重要作用。RNF170蛋白是RING家族的E3泛素连接酶，之前研究发现RNF170能够介导Ca2+通道蛋白三磷酸肌醇受体IP3R的泛素化降解，而对RNF170的其他功能知之甚少，我们研究了RNF170在细胞自噬和凋亡中的作用，提出了RNF170调控自噬的机理:通过mTOR抑制自噬。进一步完善了RNF170的功能。 研究方法 1、肿瘤细胞培养 2、自噬小体荧光聚集检测细胞自噬 3、WesternBlot检测细胞内蛋白的表达 4、流式细胞术检测细胞凋亡 5、RNAi抑制相关基因的表达 6、质粒转染过表达相关蛋白 7、免疫共沉淀检测蛋白相互作用 研究成果 1在非小细胞肺癌细胞株A549中用不同方法诱导自噬后，RNF170表达下降;用不同浓度的Salermide处理非小细胞肺癌细胞株A549和H1792后，LC3B的表达升高，而RNF170的水平下降，且这种变化具有浓度依赖性。 2在稳定表达LC3-GFP的神经胶质瘤细胞系U87-MG-LC3-GFP中，RNF170敲除后引起了自噬小体荧光聚集。 3在A549、H1792、Calu-1中敲除RNF170后用不同药物处理都引起了细胞自噬水平的升高。 4在H1792中，过表达RNF170引起细胞自噬水平下降。 5在A549、H1792、Calu-1中敲除RNF170后，m-TOR下游蛋白pp70S6K和p-4EBP1的表达水平降低;在H1792中过表达RNF170后，m-TOR下游蛋白pp70S6K和p-4EBP1的表达水平升高。 6在A549和H1792中敲除RNF170后凋亡相关蛋白PARP和Caspase3水平升高，流式细胞术检测到敲除RNF170后细胞凋亡增强 7IP3R与RNF170共敲除后自噬减弱，凋亡增强 8免疫共沉淀表明ATG3可能与RNF170相互作用 结论 1RNF170在自噬中起作用，细胞自噬发生时RNF170表达下降 2RNF170敲除后细胞自噬水平升高，过表达后自噬水平下降，RNF170能够抑制自噬的发生 3RNF170对自噬的调控通过m-TOR下游的pp70S6K和p-4EBP1起作用 4RNF170能够抑制细胞凋亡的发生 5RNF170对自噬和凋亡的调控可能与IP3R和ATG3有关 综上所述，本研究发现了E3泛素连接酶RNF170能够抑制细胞凋亡和自噬，并且提出了RNF170调节细胞自噬的分子机制:RNF170能够通过上调m-TOR下游的pp70S6K和p-4EBP1来降低LC3B的表达，从而抑制细胞自噬。RNF170能够抑制细胞凋亡，RNF170敲除后细胞凋亡增多。RNF170对细胞凋亡和自噬的调控可能与IP3R和ATG3有关。