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猪轮状病毒感染是一种猪的急性肠道传染病,造成仔猪严重腹泻和脱水,仔猪病死率高,给养猪业带来巨大损失。新型稳定、安全、高效的疫苗研究是防控该病的重要方向。本研究进行了以减毒鼠伤寒沙门氏菌为运送载体的猪轮状病毒VP7和NSP4基因疫苗的构建及其小鼠免疫试验研究。1、猪轮状病毒VP7、NSP4基因的克隆及鉴定根据基因库中猪轮状病毒OSU株基因序列,分别设计一对引物,通过RT-PCR成功扩增VP7的全序列(1062 bp)和NSP4基因的259-525位核苷酸序列(267 bp),并分别进行TA克隆。序列比对结果表明,扩增得到的VP7和NSP4序列与标准序列基本相同。2、猪轮状病毒VP7、NSP4基因的原核表达及其免疫血清的制备分别从T载体上酶切回收上述克隆及鉴定正确的猪轮状病毒VP7、NSP4基因,连接原核表达载体,构建了含有重组质粒pET28a-VP7和pET32a-NSP4的BL21表达菌。经IPTG诱导后,重组菌分别表达出约30 KDa和28 KDa的融合蛋白。纯化后的融合蛋白分别免疫家兔,制备得到了抗融合蛋白的血清。经检测,制备的两种血清中分别含有较高水平的抗融合蛋白VP7、NSP4的特异IgG抗体。3、介导猪轮状病毒VP7、NSP4基因的重组减毒沙门氏菌的构建利用平衡致死系统改造真核表达载体质粒pVAX1和pVAXD,将Kan抗性基因替换为asd基因,再将NSP4及VP7基因片段分别插入单表达的真核表达载体pVAX1-asd中,并一同插入双表达载体pVAXD-asd中,分别构建为含有VP7和NSP4基因的单表达质粒和双表达质粒,并将重组质粒分别电转化沙门氏菌χ3730,再从中提取质粒电转化减毒沙门氏菌χ4550。重组菌分别经菌落PCR鉴定,均能扩增出与目的基因大小基本相同的片段；提取质粒分别经酶切鉴定,均能酶切出与目的基因和载体片段大小基本相同的片段,表明重组减毒沙门氏菌均构建成功。4、介导猪轮状病毒VP7、NSP4基因的重组减毒沙门氏菌的生物学特性鉴定及其小鼠免疫试验分别提取减毒沙门氏菌重组质粒转染COS-7细胞,分别以制备的免疫血清为抗体血清,进行间接免疫荧光试验,均能观测到荧光现象,表明重组质粒能在COS-7细胞中表达。在无抗性生长条件下,重组减毒沙门氏菌的质粒稳定性良好。重组减毒沙门氏菌口服免疫小鼠,第3天能在回肠末端组织中检测到有目的基因转录的RNA,间接ELISA检测小鼠血清特异性抗体IgG和肠道黏膜特异性抗体IgA,结果显示双表达质粒组和混合质粒组诱导小鼠产生的血清特异抗体IgG和肠道黏膜抗体IgA水平高于单表达质粒组。