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水稻矮缩病毒(Rice Dwarf Virus,RDV)属植物呼肠孤病毒属,是跨越动、植物两界的双宿主病毒,可以在叶蝉和水稻体内复制。RDV病毒能够在叶蝉中大量增殖但不致病,在水稻中引发水稻矮缩病。一般认为,RDV更适应于它们的昆虫寄主,而不是水稻寄主,因为病毒能够借助虫卵传到后代,但不能借助植物的种子进行传播。RDV的侵染、复制和组装是一系列非常复杂的过程,很多问题还有待于进一步研究。外壳蛋白在病毒侵染过程中起主要作用,RDV的外壳主要由260个P8三聚体组成,P2位于外层外壳的三重轴对称处。我们的研究主要集中在外壳蛋白P2和P8在RDV侵染昆虫宿主过程中的作用,工作分为三个部分。
在昆虫细胞(Sf9)表面表达P2模拟它在病毒粒子表面的状态,发现在酸性环境下P2能够介导多胞体的产生,因此推测P2具有类似膜融合蛋白的作用。对P2的氨基酸序列分析结果表明:P2存在两个七肽重复区(heptad repeat,HR),在其靠近C端的1/4区域处有一个跨膜区。这些特征都与囊膜病毒膜融合蛋白一致。根据这一分析,我们构建了一系列P2缺失突变体进行膜融合实验,结果表明位于N端的七肽重复区对膜融合功能起主要作用。
P8很早就被发现具有依赖于低pH的切割机制,在其N端和C端分别具有一个切割位点,天然病毒粒子中只存在C端的断裂,而大肠杆菌表达的蛋白两种切割同时存在。我们用MgCl<,2>处理提纯的病毒粒子使病毒解壳继而获得纯化的P8蛋白。Western Blotting结果表明N端和C端都发生了断裂,说明P8在天然病毒粒子中不发生N端的断裂是由于病毒粒子的结构特点引起的。氨基酸序列分析表明P8的C端断裂产物P8N的C末端存在两性α螺旋结构域。在细胞膜上表达这个结构域会破坏细胞膜的稳定性,导致细胞膜通透性增强,胞质大量流失:当把纯化的P8和P8N蛋白与培养的昆虫细胞共同孵育时,只有P8N能够进入细胞。这些结果说明P8在其C端的断裂有助于其改变细胞膜通透性,帮助病毒粒子进入宿主细胞。
免疫共沉淀实验证明P8与水稻和昆虫的GOX都有相互作用;对表达P8和GOX的昆虫细胞进行免疫荧光结果也表明,P8在昆虫细胞中的定位受到GOX的影响而向过氧化物酶体聚集。我们推测这种相互作用可能影响了RDV在昆虫宿主细胞内的定位。综上所述,本研究有助于阐明RDV外壳蛋白在病毒侵染昆虫宿主过程中的作用,并为研究RDV侵染昆虫宿主的机制提供了依据。