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蝎(scorpion)是一种古老的物种，蝎尾部毒腺内储存的蝎毒素不仅是其捕食、御敌的重要器官，也是治疗人类某些疾病的良药。蝎毒素的主要成分是20～90个氨基酸构成的小分子多肽，一般含3～4对二硫键，可以选择性的与动物可兴奋细胞膜上的钠、钾、钙、氯离子通道结合，引起通道电流的阻断或门控动力学的改变。 本课题组的前期研究根据大肠杆菌偏爱密码子，优化了东亚钳蝎(Buthusmartrnsii Karsch，BmK)氯离子通道毒素BmK CT基因序列(Accession Number: AF135821)，并将此人工合成的基因命名为BmK CTa。该序列编码的氯离子通道毒素由35个氨基酸组成，含4对二硫键，与从以色列蝎（Leiurus quinquestriatus）中分离得到的氯离子通道毒素chlorotoxin有68％的同源性，推测它们可能具有近似的生物学功能。Chlorotoxin可以选择性的结合并抑制人脑神经胶质瘤细胞上的基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2），从而抑制神经胶质瘤细胞的转移扩散。前期的体外研究表明，rBmK CTa对神经胶质瘤细胞有较强的毒性作用，对神经胶质瘤具有潜在的治疗价值。所以，对BmK CT生物学功能的进一步研究具有一定的理论意义和应用价值。 本研究将重组东亚钳蝎氯离子通道毒素rBmK CTa进行原核可溶性表达，并获得较高纯度的rBmK CTa，分析了该毒素对神经胶质瘤细胞的迁移、侵袭能力的影响，并研究了它与细胞表面可能的受体蛋白MMP-2的相互作用关系。通过人神经胶质瘤的原位荷瘤裸鼠动物模型观察了rBmK CT在小鼠体内的代谢动力学分布。本研究的主要结果如下: 1.建立了rBmK CTa（recombinant BmK CT artifact）的可溶性表达与纯化方法。通过pRSETc表达系统将按照大肠杆菌偏爱密码子优化后的BmK CT基因在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达。Western blot表明，目的蛋白主要以单体形式存在。利用Ni-NTA亲和层析一步纯化得到了纯度较高的单体重组BmK CTa，最终每升培养液中可获得纯蛋白1.5～2.1 mg，为下一步研究其生物学功能奠定了基础。 2.分析了rBmK CTa对神经胶质瘤细胞SHG-44的迁移、侵袭能力的影响，并通过细胞免疫组化、明胶酶谱与Western blot方法，分析rBmK CTa作用前后SHG-44细胞中MMP-2的表达及活性变化。结果表明，rBmK CTa可减慢SHG-44细胞的生长与迁移速度，其抑制细胞迁移IC50为0.28μM。同时，rBmK CTa能够抑制在侵袭转移中起重要作用的MMP-2的表达，使MMP-2分泌减少，这种减少呈剂量依赖性趋势。上述结果表明，rBmKCTa通过抑制MMP-2的表达，从而抑制了肿瘤细胞与细胞外基质(ECM)的黏附及ECM的降解，降低了肿瘤细胞迁移能力。流式细胞术分析表明，0.4μM～3.2μM重组BmK CTa作用后，SHG-44细胞G0/G1期所占比例增加，S期所占比例减少，使细胞生长阻滞于G0/G1期。在3.2μM的rBmK CTa作用24 h时，细胞的凋亡率接近50％。结果提示，rBmK CTa对于神经胶质瘤具有潜在的治疗价值，有望成为新型的靶向性药物。 3.利用RT-PCR法从SHG-44细胞中克隆得到基质金属蛋白酶2(MMP-2)基因，将其C端的胞外区部分构建入表达载体pExSecI中，并在大肠杆菌中获得表达。MMP-2C主要以包涵体的形式存在，通过变复性和亲和层析，从而获得可溶的MMP-2C蛋白。利用pull down方法确定MMP-2C与rBmK CTa可以在体外相互作用。据此推测，rBmK CTa抑制MMP-2的表达，可能是通过二者的直接相互作用而实现。 4.将rBmK CTa的C末端引入2个Tyr残基，并在pExSecI分泌型表达系统中表达ZZ-rBmK CTa-Tyr，通过IgG Sepharose纯化该蛋白。用标准Iodogen法进行ZZ-rBmK CTa的131I标记，纸层析测定放化纯为90％。建立了含人神经胶质瘤的荷瘤鼠模型，经尾静脉和颅内注射分别将17.9μ Ci和2μ Ci标记蛋白注入小鼠体内。在注射给药后的10个时间段，通过SPECT观察小鼠体内标记蛋白的动力学分布。结果显示，131I-ZZ-rBmK CTa通过两种给药方式均可快速通过体液循环穿过小鼠的血脑屏障。在给药后24 h，检测标记蛋白在小鼠左脑、右脑、胃、肾脏、脾脏、肝脏、后肢肌肉、肺、心脏等12个器官的分布情况。分析表明，131I-ZZ-rBmK CTa在大脑中的比放射性量，在右脑（肿瘤）处蛋白含量明显高于左脑正常组织，T/NT值分别为1.25和4.13，说明ZZ-rBmK CTa与神经胶质瘤细胞可以特异性结合。以上结果提示，脑神经胶质细胞和神经细胞膜上的某些受体分子对rBmK CTa有较强的亲和性。