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1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39,Rubisco)是高等植物光合碳代谢中的关键酶,是由8个大亚基(rbcL)和8个小亚基(rbcs)组成的L8S8多聚体复合物,其中小亚基在调控大亚基方面起重要作用。经过长期极端环境条件的自然选择,新疆雪莲自身形成了独特的光合保护机制,在低温条件下能够保持较高光合活性。本研究分别用组成型和冷诱导型启动子调控新疆雪莲Rubisco小亚基基因(sikrbcs2)在烟草和番茄中的表达。通过不同的低温胁迫处理,分析转基因植物和对照植物的叶绿体色素含量、叶绿素荧光参数变化、光合参数的变化、抗氧化酶活性变化以及低温条件下的生长特性等,以此来研究新疆雪莲sikrbcs2基因在低温条件下可能的光合保护机制。结果如下: (1)生物信息学分析表明:该基因包含l个420bp的完整开放阅读框,编码139个氨基酸,所编码蛋白质理论等电点是7.58,分子量为15.1093 kD,不具有跨膜区域,为亲水性较强的蛋白。氨基酸多序列比对表明,与向日葵的相似性最高达到57.54％;系统进化树表明该蛋白与菊花亲缘关系最近。 (2)以25℃、16℃、10℃、6℃、4℃温度梯度处理野生型和转sikrbcs2基因型烟草,叶绿体色素含量表明,在低温胁迫下,转基因型烟草叶片叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)、叶绿素a+b(Chla+Chlb)、类胡萝卜素(Car)含量都显著高于野生型烟草。叶绿素荧光参数表明,在低温胁迫下,转基因烟草PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、qp(光化学猝灭系数)、ETR(电子传递效率)虽都有所下降,但与野生型烟草相比,其下降幅度均较小。转基因烟草的非光化学猝灭系数(qN)高于野生型烟草。光合参数表明,随着低温胁迫程度的加剧,转基因烟草和野生型烟草净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)总体都呈下降趋势,但转基因烟草的净光合速率有一个明显的动态变化,先急剧下降后有一个稳定上升的趋势。抗氧化酶活性表明,在低温胁迫条件下,转基因烟草 APX酶活性与WT型烟草有显著差异。通过对生长指标的测定发现,在低温处理后转基因烟草叶片生长指数、株高、茎粗、地上部分鲜重、地下部分鲜重、地上部分干重、地下部分干重都要高于野生型烟草。 (3)以25℃、16℃、8℃、4℃温度梯度处理野生型和sikrbcs2型番茄,叶绿体色素含量表明,随着胁迫温度的降低,转 sikrbcs2基因型番茄的 Chla、Chlb、Chla+Chlb的含量都极显著高于野生型番茄,而 Chla/Chlb的值与野生型番茄基本保持一致,类胡萝卜素含量也高于野生型番茄。叶绿素荧光参数表明,转基因番茄在低温胁迫条件下PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)和潜在光化学活性(Fv/Fo)都显著高于野生型番茄,转基因型番茄的qP值与野生型番茄相比下降幅度要小,电子传递效率ETR值也显著高于野生型番茄的。光合参数表明,随着胁迫温度的降低,野生型番茄和转基因番茄的净光合效率 Pn都呈下降趋势,但转基因番茄净光合速率要显著高于野生型番茄,气孔因素是导致净光合速率下降的主要因素。 综上所述,新疆雪莲sikrbcs2基因在低温条件下可能的保护机制为:在转sikrbcs2型烟草和番茄中,新疆雪莲Rubisco小亚基可能与受体植物的Rubisco酶的大亚基重新组装形成了Rubisco杂合酶,Rubisco杂合酶在低温条件下保持较高的活性。光化学效率较高的光合电子传递链产生了较多的同化力可以满足暗反应的需要;同时也可能是通过光呼吸作用耗散了过剩的光能,降低了过剩的光能对光合机构的损伤,起到了一定的保护作用。