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新城疫(Newcastle Disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)强毒株引起的烈性、高度接触性传染病,在世界范围内流行,感染多种禽类,给养禽业造成巨大经济损失。NDV基因组结构为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’,其中P基因能通过"RNA编辑”产生结构蛋白P及非结构蛋白V和W,P/V/W蛋白具有相同的氨基端和不同的羧基端。NDV V蛋白被认为是毒力因子之一,与其IFN通路拮抗能力有关,也与NDV溶瘤特性相关。目前关于NDV V蛋白拮抗IFN信号具体机制的研究尚不多见,有研究表明V蛋白能通过降解STAT1(Signal transducer and activator of transcription1, STAT1)发挥阻断IFN信号的作用。然而另一研究结果发现,在NDV感染细胞及V蛋白过表达细胞系中,STAT1蛋白能与V蛋白共存,暗示存在其他的IFN信号阻断机制。为了进一步研究V蛋白拮抗IFN信号的具体机制,本文通过多种NDV毒株感染多种细胞,以及NDV真核表达质粒转染等技术手段,检测IFN信号通路中关键蛋白的表达水平及磷酸化修饰水平,鉴定与之相关的病毒蛋白,阐明其作用机制。最终,利用V蛋白缺失株ZJ1-Vs对实验结果进行验证。本研究的结果为NDV P基因编码蛋白P/V/W在拮抗Ⅰ型IFN信号通路中的功能提供了新的见解。1.三种基因型NDVP/V/W真核表达质粒构建及多克隆抗体的制备为获得检测V蛋白表达的抗体,本研究通过扩增NDV9a5b毒株V蛋白PNT结构域和CTD结构域,以及ZJl毒株V蛋白CTD结构域,连入原核表达载体pET-28a或pColdTF进行原核表达,蛋白纯化后免疫小鼠,获得9a5b V蛋白和ZJ1VCD多克隆抗体。同时利用Overlapping PCR构建了9a5b、La Sota和ZJl毒株V和W蛋白真核表达质粒。结果显示,9a5b V蛋白多抗和ZJ1VCD多抗反应性良好,可用于V蛋白表达检测。9a5b、 La Sota和ZJl毒株V和W蛋白真核表达质粒也构建成功并正确表达。NDV感染人源细胞系HeLa和禽源细胞系DFl后V蛋白表达存在宿主差异,易感宿主鸡源DF1细胞中V蛋白表达量更高,而在哺乳动物细胞中,V蛋白并不能有效表达。2.NDVV蛋白介导STAT1降解的毒株差异分析为验证NDV对IFN信号通路中关键蛋白STAT1的作用,本实验使用9a5b、La Sota和ZJl等NDV毒株感染和V蛋白真核表达质粒转染HeLa和Vero细胞。Western-blot检测相关蛋白的表达水平,比较转染、感染单一作用或共同作用下,细胞内STAT1的变化水平。结果发现,NDV感染HeLa和Vero细胞STAT1降解不明显,转染V蛋白后也得到同样的结果。有趣的是,只有在转染V蛋白后感染NDV, STAT1才出现明显的降解,且不同毒株之间存在差异。该结果表明,V蛋白对STAT1的降解作用受到毒株差异、感染后细胞生物学活动变化或其他病毒蛋白的影响。3.NDV P基因编码蛋白对STAT1磷酸化水平的影响及反向遗传毒株验证根据上述实验结果,我们推测V蛋白可能通过其他途径间接地诱导STAT1蛋白的降解。众所周知,STAT1蛋白磷酸化是IFN信号通路激活的重要环节。为验证V蛋白是否与磷酸化STAT1(p-STAT1)相互作用,本研究通过外源IFN-a刺激,NDV感染及真核表达质粒转染,泛素抑制剂处理,并最终通过反向遗传V蛋白缺失株ZJl-Vs验证,NDV V蛋白通过针对性介导p-STAT1蛋白发生泛素蛋白酶体依赖的降解来发挥拮抗IFN信号的作用,同时还发现一些毒株P和W蛋白也具有V蛋白样功能。此外,IFN-γ刺激实验显示,NDV无法抑制IFN-γ诱导的p-STAT1产生,表明NDV能拮抗Ⅰ型IFN信号而不影响Ⅱ型IFN系统。本研究阐明了NDV拮抗IFN信号通路的具体机制,同时首次发现NDV P基因编码蛋白P/V/W蛋白具有相似的功能,为研究NDV逃避先天性免疫反应机制打开了新的视野和思路。