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第一章H5N1亚型高致病性禽流感病毒siRNA靶向制剂的研究背景高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza, HPAI)是由H5亚型或H7亚型禽流感病毒感染所致的一种禽类的烈性传染病。由高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)引起的大流行,已造成近亿只的禽类死亡和重大的经济损失。其爆发常常是毁灭性的,危害性很大。因此,高致病性禽流感被国际兽疫局定为A类传染病。H5N1亚型高致病性禽流感病毒突破种间障碍直接感染人于1997年在中国香港被首先报道,之后其致病性和传播能力不断增高,人H5N1禽流感病例持续出现,这引起了世人的震惊和关注。目前,全世界已有58个国家和地区发现H5N1亚型禽流感病毒感染人类的病例,病死率超过60%。这种严峻的形势也说明目前的疫苗和抗流感药物(如达菲)并不能有效地控制和治疗人H5N1高致病性禽流感。鉴于H5N1高致病性禽流感对人类健康造成的巨大威胁,新的抗H5N1亚型高致病性禽流感病毒药物的开发和研制变得日趋迫切。有鉴于此,本论文开展了H5N1亚型高致病性禽流感病毒siRNA靶向制剂的研究。方法本研究利用聚乙烯亚胺(PEI)可以结合核酸和蛋白的特性,通过带有负性氨基酸尾(D4S×5)的HA单链抗体(ScFv-Tail)靶向传递siRNA：利用ScFv-Tail识别感染了病毒的宿主细胞表面的血凝素蛋白(HA),精准定位感染细胞；PEI作为一种多聚阳离子聚合物紧密结合带有负电荷的ScFv-Tail和siRNA,这样通过ScFv-Tail靶向传递siRNA进入细胞后发挥抑制病毒复制的能力。在MDCK细胞上,通过流式细胞术观察靶向制剂的转染效果,并于接毒前和接毒后加入靶向制剂观察其抑制病毒复制的能力,通过实时定量PCR检测H5N1流感病毒的NP、PA和PB1基因的相对表达量,Western blot和间接免疫荧光实验(IFA)检测病毒NP蛋白的表达情况。同时,观察靶向制剂对H5N1流感病毒在小鼠肺内复制的抑制作用和其对H5N1流感病毒攻毒小鼠的保护作用。结果流式细胞术结果显示,在接毒后的MDCK细胞(infectious cell)上,靶向制剂的转染效率高于DNA/PEI组(P<0.05)；病毒滴度测定(TCID50)结果显示,接毒前加入靶向制剂,病毒滴度略微下降,与PEI／siRNA组相比没有显著性差异(P>0.05),接毒后加入靶向制剂,病毒滴度显著下降,存在显著性差异(P<0.05)；实时定量PCR结果显示,与PEI/siRNA组(PP组)相比,靶向制剂组(STPP组)的NP mRNA、PA mRNA的表达水平更低,但是PB1 mRNA水平变化不大(P>0.05);Western blot结果表明,接毒后STPP组的NP蛋白表达量最低,显示了很好的抑制禽流感病毒NP蛋白表达的能力；IFA结果显示,STPP组的红色荧光最低,靶向制剂极大地抑制NP蛋白的表达,表现出很好的靶向抑制病毒复制的能力。动物实验结果表明,靶向制剂对H5N1流感病毒在小鼠肺内复制具有抑制作用,并对攻毒小鼠具有部分保护作用。其中,STPP组的小鼠存活率为60%,PP组的小鼠存活率为40%,而对照组小鼠全部死亡,差异显著(P<0.05; log-rank test)。结论细胞实验和动物实验结果显示,构建的靶向制剂可以有效降低接毒后流感病毒在MDCK细胞上的复制,可以降低攻毒后H5N1流感病毒在小鼠肺组织中的复制,还对攻毒后小鼠具有部分保护作用(生存率60%)。这些结果说明,这种靶向传递系统可以用于治疗H5N1亚型高致病性禽流感。第二章PA基因特异性siRNA抑制H5N1亚型高致病性禽流感病毒复制的研究目的设计针对H5N1亚型高致病性禽流感病毒PA基因的干扰RNA (siRNA),研究其在细胞水平和动物体内抑制流感病毒复制的效果。方法根据siRNA设计原则,设计并合成3对针对H5N1亚型高致病性禽流感病毒PA基因的siRNA,构建表达性质粒(ps-PA496, ps-PA1116, ps-PA1473),分别转染MDCK细胞并接毒,通过病毒滴度测定、real-time PCR和间接免疫荧光实验在细胞水平检测siRNAs抑制AIV复制的效果。根据细胞实验结果,选用有效的siRNA(ps-PA496)探讨其对H5N1流感病毒在小鼠肺内复制的抑制作用和攻毒保护作用。结果设计的3对siRNA1中,ps-PA496显著抑制AIV在MDCK细胞中的复制,病毒滴度与对照组相比降低78倍。Real-time PCR和间接免疫荧光实验结果表明,设计合成的3个siRNA均对PA基因的转录和表达产生显著的抑制作用,其中PA-496的抑制作用最强。体内实验表明,ps-PA496通过PEI尾静脉注射传递到肺组织后,能够有效降低H5N1 HPAIV感染小鼠的肺病毒滴度(P<0.05)；而且,ps-PA496组的攻毒小鼠体重减轻幅度较对照组小,且能够部分保护小鼠遭受致死性流感病毒的攻击(生存率37.5%)。结论本研究针对PAN的E154-R170保守区筛选并合成的ps-PA496具有最好的抗禽流感病毒复制的作用,为干扰RNA预防和治疗H5N1 HPAIV提供合理的技术支持和物质储备。同时,也提示PA的E154-R170保守区可以作为新型抗流感病毒药物设计和作用的靶标。