论文部分内容阅读
表皮蛋白是昆虫外骨骼的主成分。由于昆虫在生长发育的进程中需要不断更新外骨骼的组成，为此，昆虫表皮蛋白具有特异性的表达谱。为探讨表皮蛋白在昆虫蜕皮与变态方面的调控机理，本试验采用基因工程技术和生物信息学的方法，研究了蜕皮激素(20E)、启动子、内含子对表皮蛋白基因BMWCP3的表达调控作用，对候选转录因子BMFTZ-F1进行了克隆表达分析，主要研究结果如下：
1.采用PCR技术从家蚕蛹期翅原基基因组DNA中扩增出2250bp的BMWCP3启动子和BMWCP3第一内含子序列。
2.启动子生物信息学分析表明，克隆的BMWCP3基因启动子在转录起始点上游一20～一35有真核基因启动子特有TATA盒。该启动子还有许多受蜕皮激素调控的相关转录因子的结合位点，如：BRC-Z1、BRC-Z2、BRC-Z3、BRC-Z4和FTZ。
3.通过BMWCP3启动子5’端序列缺失，克隆了5个长度不同的启动子片段，并将这些片段插入pGV-B，构建得到5个启动子缺失片段重组荧光素酶报告载体pGV-2250、pGV-1599、pGV-868、pGV-723和pGV-155。将这些载体与pHRG-HSP瞬时共转染sf9细胞，利用双荧光素酶报告基因系统检测各个启动子片段的活性，显示启动子区+1～一868bp活性最强，启动子区一868～一1599bp可能存在负调控元件，一1599～一2250bp存在正调控元件。
4.20E对pGV-868瞬时转染后的sf9细胞分别进行5h和48h的诱导处理，结果显示BMWCP3启动子对20E产生了应答，20E短暂诱导5h能够极大增强启动子区+1～一868bp的活性，而20E持续诱导48h则抑制其活性。
5.通过BMWCP3第一内含子序列的缺失或位移，构建了6个内含子研究的荧光素酶报告载体pGV-L3、pGV-L4、pGV-L5、pGV-L6、pGV-L9和pGV-L10。将这些载体瞬时转染sf9细胞，测定相对荧光素酶活性，分析第一内含子对BMWCP3表达的作用。结果显示第一内含子是BMWCP3基因表达所必需的，缺失第一内含子会抑制基因表达。
6.可溶性分析显示重组蛋白BmFTZ-F1以包涵体形式在BL-21中进行原核表达。功能结构域分析表明BMFTZ-F1是核受体蛋白，是BMWCP3基因的候选转录因子，对其有调控作用。