论文部分内容阅读
结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)是一种重要的十字花科蔬菜，在蔬菜周年供应中占有重要地位。近年来，随着栽培面积的逐年扩大，甘蓝的虫害日趋严重，其中以鳞翅目的小菜蛾(Plutella xylostella)和菜青虫(Pieris rapae)等为害最为严重。目前生产上害虫的防治以施用化学药剂为主，但化学农药污染环境、对人畜有害，且一些害虫已对多种化学杀虫剂产生了抗药性。培育抗虫品种是防治害虫最有效的方法，但在甘蓝中抗虫资源缺乏。利用植物基因工程技术将外源抗虫基因转入甘蓝，可为甘蓝育种提供有效的抗虫种质资源。
crylIa8和crylBa3基因是由中国农业科学院植物保护研究所自主分离克隆的。CrylIa8毒蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟具有很强的杀虫活性，CrylBa3毒蛋白对小菜蛾、小猿叶甲和家蝇具有很好的控制作用，并且CrylIa8和CrylBa3与生产上常用的CrylA类毒蛋白之间没有交互抗性。创制同时含有crylIa8和crylBa3双价基因的Bt甘蓝，可以有效地抑制小菜蛾抗性的产生，为小菜蛾的抗性治理提供强有力的支持。
本研究优化了甘蓝的再生体系和遗传转化体系，利用根癌农杆菌介导法将crylIa8和crylBa3双价基因导入甘蓝高代自交系，主要研究结果如下：
1.甘蓝再生体系的优化
以4个甘蓝自交系为材料进行了再生体系的优化：苗龄控制在5 d，选用下胚轴为外植体，激素配比为6-BA2 mg/L+NAA0.1 mg/L的MS培养基，并添加有AgNO33 mg/L时，可显著提高不定芽的分化率，最高再生频率达到96.87％。
2.甘蓝高效遗传转化体系的建立
以重组质粒表达载体pCSIaN(含crylIa8基因)转化甘蓝，优化了农杆菌介导的甘蓝遗传转化体系：当选择培养基中激素配比为6-BA2 mg/L+NAA0.1 mg/L，并添加有AgNO33 mg/L、Timentin150 mg/L时能显著促进不定芽的再生，转化频率最高可达到10.42％。
3.甘蓝转crylIa8和crylBa3双价Bt抗虫基因植株的获得
利用根癌农杆菌介导法将crylIa8和crylBa3双价基因导入甘蓝中，共获得41株卡那霉素抗性植株；分子检测证明crylIa8和crylBa3双价基因已被成功整合到甘蓝基因组中并得到表达；其中PCR检测阳性植株33株，Southern blot检测阳性植株27株，RT-PCR和Western blot检测均为阳性的植株有24株；抗虫性鉴定结果表明部分转基因植株不仅对敏感小菜蛾具有很强的杀虫活性，而且对CrylAc抗性小菜蛾也有很好的控制作用。