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贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii,Cb）是人类Q热的病原体,主要通过气溶胶传播,对人和动物感染性强。人类感染Q热主要表现为急性流感样症状,以发热、头痛为主,可能会引起慢性感染[1],最常见的是心内膜炎[2]。贝氏柯克斯体九里株源自美国[3],是Q热研究中常用的参考菌株[4]。九里株在体外传代培养时易发生变异,由有毒的I相菌变异为弱毒的Crazy相[5]或无毒的II相[6,7]。过去几十年里一直认为贝氏柯克斯体是专性胞内寄生菌,不能在细胞外培养。传统的培养方法主要是感染动物、鸡胚培养和细胞培养,2009年美国NIH落基山实验室发明了贝氏柯克斯体无细胞培养方法[8]。无细胞培养技术提高了贝氏柯克斯体的培养效率,并简化了遗传操作的方法[8,9]。国外的研究发现贝氏柯克斯体是严格微好氧菌,无细胞培养需要一定浓度的氧气,但是氧浓度不超过10%[8,9,10]。本研究第一部分是对九里II相株进行克隆分纯和全基因组序列分析。贝氏柯克斯体培养周期长,体外培养时易发生适应性变异,个别情况下同时培养不同分离株时还可能发生交叉污染从而误导研究结果,有必要对研究用九里II相菌株进行遗传学鉴定。参考国外贝氏柯克斯体遗传操作方法[9],用半固体平板法克隆分纯贝氏柯克斯体九里II相株。随机选择一个单克隆CB01,对其扩大培养后提取基因组,进行二代和三代全基因组测序分析。将测序结果与国外贝氏柯克斯体不同克隆株的基因组进行比较分析,了解我室保存的九里II相菌株和国外九里菌株的异同。将二代数据拼接并用三代测序数据清洗拼接结果,得到CB01的全基因组序列。通过对测序数据的分析和比对,CB01的基因组全长为2.024 Mb,包含一个1.987Mb的环状染色体和一个37.321 Kb的质粒。与九里I相菌（RSA 493克隆）基因组[11]相比,CB01多出5个重复序列,有1个25997 bp的删除区,23个单核苷酸多态性位点（SNP）差异。与九里II相菌（RSA 439克隆）基因组[12]相比,CB01同样多出5个重复序列,但仅有6个SNP差异。CB01与RSA 439的CBU0533基因序列完全相同,可解释CB01缺失O抗原从而成为II相菌。可见贝氏柯克斯体九里II相克隆株CB01与国外II相株RSA 439高度同源,CB01可用作国内贝氏柯克斯体研究用参考菌株。本研究第二部分是分离鉴定九里II相株兼性好氧突变体,鉴定不同菌株在不同培养基和不同氧气浓度等条件下的生长繁殖。我们在培养一株九里II相转化菌的过程中,发现该转化菌可在20%氧气浓度条件下静置培养时可正常生长。该菌是通过电转化的方法[13],向野生九里II相菌中转入一个外源质粒构建而成。该质粒以pMMB207质粒为基础,基于RSF1010 ori而构建,包含绿色荧光蛋白（GFP）基因,抗生素筛选标记和质粒复制调控区,能在贝氏柯克斯体中稳定传代[13]。首先通过转化得到转化菌NM IIpMMGK并对该转化菌进行克隆分纯。然后以野生九里II相菌和野生Henzerling I相菌为对照,测试了两种培养基,即ACCM-2和ACCM-2+0.5 mM色氨酸（Tryptophan,Trp）;两种氧气浓度,分别为20%和2.5%,以及三种接种浓度下贝氏柯克斯体的生长情况。分别收集初始接种物和培养7天后的产物,提取DNA并用qPCR定量的方法对贝氏柯克斯体基因组进行定量。转化菌NM IIpMMGK可以在20%氧气浓度条件下正常生长,但是并不稳定,需要适宜的起始浓度和新鲜菌种。转化菌NM IIpMMGK在20%氧浓度条件下生长依然需要5%二氧化碳（CO2）。另外,本研究发现野生型九里II相菌在20%氧浓度条件下也可进行有限的生长,也需要适宜的起始浓度,新鲜培养物和5%CO2,同时需要ACCM-2培养基中含有0.5mM色氨酸。在上述所有条件下,Henzerling I相菌均不能生长。本实验用贝氏柯克斯体九里II相株CB01克隆与国外发表的九里II相株高度同源,两者的基因组序列只有个别微小差异。我们发现不同菌株对氧气的耐受程度存在区别。贝氏柯克斯体转化菌NM IIpMMGK在一定条件下可以在20%氧浓度条件下正常生长,野生型九里II相菌在20%氧气中可有限增殖,而野生型Henzerling I相菌只能在微氧浓度条件下生长。贝氏柯克斯体在20%氧浓度条件下的生长机制有待进一步研究。本实验证实了我室保存的贝氏柯克斯体九里株II相菌与国外九里株II相菌基因组差异较小,可以作为贝氏柯克斯体研究用标准菌株,有利于今后实验的继续进行。同时发现并分离出兼性好氧突变体,为贝氏柯克斯体的培养提供了新的思路。本研究对贝氏柯克斯体在20%氧浓度条件下的生长特性做了鉴定,对探索贝氏柯克斯体氧气代谢机制的研究具有参考意义。