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背景： 流行病学研究发现二甲双胍能降低糖尿病患者发生胰腺癌的风险或改善糖尿病相关胰腺癌的预后。活化的胰腺星状细胞(pancreatic stellate cell，PSCs)是胰腺炎及胰腺癌纤维化的主要效应细胞。随着对肿瘤基质成分PSCs的认识，其已成为治疗胰腺癌的新靶点。然而，关于二甲双胍对PSCs影响的研究甚少。有机阳离子转运体1（The organic cation transporter member1，OCT1），位于肝细胞基底膜外侧部，是肝脏摄取二甲双胍的主要转运体。二甲双胍抑制糖异生的关键机制是激活AMPK信号通路。AMPK作为生物能量代谢调节的感受器，在调节代谢途径方面起着至关重要的作用。因此，本研究目的是确定人PSCs是否表达OCT1，观察二甲双胍对PSCs增殖和ECM合成的影响，以及OCT1在二甲双胍作用过程中的潜在分子机制。 第一章 活化的人胰腺星状细胞表达有机阳离子转运体1 目的：明确培养的人PSCs与胰腺癌组织中PSCs是否表达OCTs。 方法：（1）分离培养人PSCs，行反转录PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)，跑琼脂糖凝胶电泳，荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR，qPCR)，及蛋白印迹试验(Western blot)，检测PSCs上是否有有机阳离子转运体1、有机阳离子转运体2、有机阳离子转运体3(organic cation transporter member1，2，3，OCT1，OCT2，OCT3)的表达。（2）病理科收集胰腺癌组织及对应的癌旁组织。石蜡切片行马松染色(Masson’s staining)和免疫组化分析α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA)与有机阳离子转运体1（organic cation transporter member，OCT1)，观察胰腺癌组织中胶原蛋白(Collagen，Col)沉积，PSCs及OCT1的分布，评估胰腺纤维化和PSCs活化及OCT1表达情况。 结果：（1）培养的人PSCs表达OCT1基因，但不表达OCT2和OCT3基因，且翻译OCT1蛋白。（2）Masson’s染色结果显示：胰腺癌间质部及邻近的癌旁组织均出现明显的胶原沉积。免疫组化结果显示：胰腺癌间质中存在大量α-SMA阳性的PSCs，且有大量的OCT1分布。而癌旁组织中活化的PSCs较胰腺癌基质部明显减少，且极少的PSCs表达OCT1蛋白。 结论：本课题首次在培养的人PSCs及胰腺癌组织中发现活化的PSCs表达OCT1，为后续进一步研究二甲双胍通过OCT1进入PSCs进而对PSCs增殖和功能等生物学特性的影响及其相关信号通路提供了依据。 第二章 二甲双胍对人胰腺星状细胞活性的影响及其相关机制 目的：观察二甲双胍对PSCs增殖及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成等生物学特性的影响及其相关信号传导通路。 方法：(1)Western blot法检测不同浓度二甲双胍对PSCs的单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(Adenosine5-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK)信号通路激活情况。（2）Ki-67检测二甲双胍对活化PSCs增殖的影响。(3)qPCR和Western blot、免疫荧光染色法分别检测二甲双胍对活化PSCs ECM蛋白合成的影响。（4）利用AMPK抑制剂Compound C后，观察二甲双胍对PSCs增殖与ECM相关蛋白合成的影响，并分析相关的分子机制。 结果：（1）以不同二甲双胍浓度(0-10mM)及不同时间点（0min，10min，30min，60min）刺激PSCs，发现不同浓度的二甲双胍可激活p-AMPK，且5mM的二甲双胍激活p-AMPK的水平最强，为对照组的1.86倍(p＜0.001)。此外，二甲双胍在干预PSCs60min时能明显激活p-AMPK(p＜0.001)。（2）Ki-67结果显示，二甲双胍抑制PSCs增殖，与对照组相比，二甲双胍组的PSCs增殖能力明显降低（P＜0.05）。（3）qPCR结果显示，二甲双胍组活化的PSCs合成collagen I和fibronectin等ECM蛋白的能力低于对照组（p＜0.001）。Western blot与免疫荧光染色均显示相同趋势，即二甲双胍组明显低于对照组（p＜0.001）。（4）加入compound C后，compound C减弱二甲双胍对PSCs的增殖抑制作用；qPCR，Western blot，免疫荧光检测ECM的结果均显示，compound C能够几乎完全恢复二甲双胍抑制PSCscollagen I，fibronectin的合成。 结论：二甲双胍激活AMPK信号通路，二甲双胍抑制PSCs的增殖和ECM蛋白的合成。阻断AMPK通路可阻断二甲双胍抑制PSCs增殖和ECM合成。二甲双胍通过激活AMPK抑制PSCs增殖和ECM合成。 第三章 二甲双胍通过有机阳离子转运体1影响胰腺星状细胞活性 目的：在实验第一部分中，我们已观察到PSCs表达OCT1。OCT1是肝脏摄取二甲双胍的主要阳离子转运体。OCT1是否是PSCs摄取二甲双胍的主要阳离子转运体，值得进一步证实。在第二部分研究中，我们发现二甲双胍通过AMPK信号通路抑制PSCs增殖及ECM产生。为了进一步证实OCT1在二甲双胍激活AMPK及抑制PSCs增殖和纤维化反应中的作用，我们利用RNA干扰技术，干扰OCT1后，观察二甲双胍对AMPK信号通路以及PSCs增殖及ECM相关蛋白合成的影响，并分析可能的分子机制。 方法：（1）利用上海吉玛公司合成的siRNA OCT1进行OCT1干扰实验，具体步骤根据RNAi产品手册进行操作。利用qPCR及Western blot检测RNAi效果。（2）转染OCT1后，Western blot法检测二甲双胍对AMPK信号通路激活情况。（3）转染OCT1后，Ki-67检测二甲双胍对活化PSCs的增殖影响。(3)转染OCT1后，qPCR和Western blot法分别检测二甲双胍对活化PSCs合成ECM蛋白的影响。 结果：（1）利用qPCR检测RNAi效果，结果表明，干扰48h后，与mock组相比，基因沉默效果达到78%，且可持续至72h。同时在蛋白水平验证OCT1基因沉默效果，结果表明，干扰72h后，OCT1蛋白的表达水平降低至58%。（2）转染OCT1后，与对照组相比，二甲双胍激活AMPK作用减弱。（3）转染OCT1后，与对照组相比，二甲双胍抑制PSCs增殖作用减弱。（4）mRNA和蛋白质水平上检测collagen I和fibronectin的表达情况，结果发现OCT1基因沉默后，二甲双胍抑制PSCs合成ECM的能力明显降低。 结论：二甲双胍可能通过OCT1进入PSCs，进而激活AMPK，抑制PSCs增殖和ECM合成，为二甲双胍抗肿瘤机制提供新的线索。