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目的:
小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞,在各种神经系统疾病伴随的炎性反应中扮演着关键角色。因而研究小胶质细胞活化对神经系统炎性反应的损伤和修复有着重要的意义。实验中我们利用脂多糖激活小胶质细胞,研究其活化过程中炎性细胞因子的释放及其信号转导机制。
磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(PC-PLC)是各种细胞中普遍存在的一种重要的酶,能特异性水解磷脂酰胆碱生成磷酸胆碱和二酯酰甘油,后者作为细胞内的第二信使,可进一步激活蛋白激酶C,进而将信号传递给丝裂原蛋白激酶,引起细胞增殖、分化和凋亡等多方面功能的改变。PC-PLC在神经系统发育和炎症反应的信号通路中具有重要作用。我们利用其特异性抑制剂D609研究PC-PLC调节小胶质细胞活化过程中的作用,为阐明PC-PLC在小胶质细胞活化过程中的作用机制提供实验证据,同时为临床上治疗神经系统疾病奠定理论基础。
研究方法:
1.倒置显微镜下观察细胞形态变化
2.小胶质细胞活化的检测
1)倒置显微镜下观察细胞形态变化。
2)ELISA检测炎性细胞因子TNF-a、IL-1β的活性,评价小胶质细胞的活化。
3)利用硝酸还原酶法,检测炎性介质NO含量变化。
3.利用PC-PLC特异性抑制剂D609,研究PC-PLC在小胶质细胞活化中的作用
1)用MTT方法,检测D609的细胞毒性作用。
2)PC-PLC活性检测。
3)ELISA检测炎性细胞因子ZNF-a、IL-1β的活性,来评价PC-PLC在小胶质细胞活化中作用
4)利用硝酸还原酶法,检测炎性介质NO含量变化。
4.PC-PLC在小胶质细胞活化中的作用机制
1)用Westernblot方法,检测p38MAPK、JNK、ERK蛋白磷酸化水平。
2)利用一氧化氮合酶(NOS)试剂盒,检测iNOS活性。
结果:
1.BV2小胶质细胞培养
通过倒置相差显微镜观察,BV2细胞成簇分布,胞体较小,胞浆浓缩,折光性强,清晰明亮。
2.LPS可激活小胶质细胞
2.1LPS刺激BV2细胞形态学变化观察结果
使用1μg/mlLPS处理BV2细胞24h,细胞形态出现明显变化,细胞胞体形态由正常的阿米巴样变为扁平状,胞体变大,较铺展,突起明显减少或者无突起,细胞多数悬浮。
2.2LPS能够有效的诱导小胶质细胞活化
本研究用ELISA法检测发现1μg/mlLPS刺激BV2细胞24h后,处理组细胞产生并释放大量的炎性因子TNF-α,与正常对照细胞升高约10倍,差异显著(P＜0.01)。炎性因子IL-1β升高2倍,差异显著(P＜0.01)。
2.3LPS能够活化小胶质细胞,释放炎性介质NO
本研究利用硝酸还原酶法检测BV2培养液中NO的含量,发现当用1μg/mlLPS刺激BV2细胞24h后,培养液中NO含量为28.14μmol/L,比正常对照组细胞的12.35μmol/L增高两倍,差异极为显著(P＜0.01)。
3.PC-PLC参与BV2小胶质细胞活化
3.1PC-PLC抑制剂D609对小胶质细胞的细胞毒性作用
在有血清条件下,50-200μM的D609能够有效的抑制PC-PLC活性,且呈浓度依赖性。MTT法检测发现在有血清存在的条件下,10-100μMD609处理BV2细胞12-48h对细胞的存活率没有影响,而200μMD609处理BV2细胞24h和48h能够抑制细胞存活。因此,本研究中利用D609阻断PC-PLC活性的作用浓度为100μM。
3.2PC-PLC参与调节小胶质细胞活化中炎性细胞因子的释放
本研究用ELISA法检测发现1μg/mlLPS能够活化BV2细胞24h后,产生并释放大量的炎性因子TNF-α和IL-1β。100μMD609预处理30min阻断PC-PLC活性,能够有效的抑制炎性因子TNF-α和IL-1β的释放。
3.3PC-PLC参与小胶质细胞活化中NO的释放
本研究利用硝酸还原酶法检测BV2培养液中NO的含量,发现当用1μg/mlLPS刺激BV2细胞24h后,培养液中NO活性与正常对照组细胞相比显著升高。D609能够抑制由LPS诱导的NO释放。
4.PC-PLC调节小胶质细胞活化作用机制
4.1PC-PLC通过调节SAPK/JNK和p44/42信号通路介导小胶质细胞的活化。
使用1μg/mlLPS活化BV2细胞30min后,p38蛋白磷酸化不明显,而SAPK/JNK和p44/42蛋白磷酸化水平显著升高。用D609预处理阻断PC-PLC活性,能够抑制SAPK/JNK和p44/42的磷酸化。
4.2PC-PLC通过调节iNOS活性参与介导小胶质细胞的活化。
研究结果表明1μg/mlLPS活化BV2细胞,细胞培养液中总的TNOS和诱导型iNOS活性显著升高(P＜0.01),而结构型cNOS活性变化不明显。用D609预处理阻断PC-PLC活性,能够明显抑制iNOS活性的升高(P＜0.01)。
结论:
1.LPS可激活BV2小胶质细胞,实验组炎性细胞因子IL-1β、TNF-α水平明显高于对照组。
2.PC-PLC参与BV2小胶质细胞活化,利用PC-PLC特异性抑制剂D609,能够有效的抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、NO的释放。
3.PC-PLC通过调节iNOS活性,参与介导小胶质细胞的活化。
4.PC-PLC通过调节激活SAPK/JNK和p44/42信号通路介导小胶质细胞的活化。