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根据PRRSV美洲型毒株VR-2332株的基因序列,设计了GP5基因特异性引物P1/P2,利用RT-PCR扩增出PRRSV JL/07/SW分离株GP5基因,以pMD18-T为载体对GP5基因进行克隆。序列测定表明,GP5基因全长603bp,编码201个氨基酸;序列分析表明,GP5基因与VR-2332株和LV株核苷酸同源性分别为91.6%及48.7%,编码氨基酸同源性分别为87.6%及60.0%。
将GP5基因亚克隆到pGEX-4T-1表达载体中,构建表达质粒pGEX-4T-GP5。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,结果表达出约48KDa融合蛋白,蛋白大小与预期相符,经Westem-blot免疫印迹分析,重组蛋白与抗PRRSV的阳性血清发生特异性反应,表明其具有抗原活性。
用重组表达融合GP5蛋白作为包被抗原,建立了诊断PRRS的间接ELISA方法。实验确定了最佳抗原包被浓度为2.30μg/mL,PRRSV阳性血清稀释度为1:100。用间接ELISA方法检测猪细小病毒病、猪瘟、猪戊肝病毒阳性血清无交叉反应,特异性强。
本论文研究PRRSV GP5克隆与分析,应用DNA重组技术将PRRSV GP5基因与原核表达载体连接和间接ELISA方法建立,对PRRSV JL/07/SW株的病原分子生物学特点进行深入研究,并建立了初步的诊断方法。该研究对于PRRS的病原学研究、流行病学调查及诊断防治均具有重要意义。