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很多天然活性化合物的生物合成基因簇中存在聚酮合酶和非核糖体肽合成酶,聚酮合酶系中保守性很高的酮基还原酶、甲基甲酰-coA转移酶和非核糖体肽合成酶中保守性很高的腺苷腺化酶可以作为重要的探针用于天然聚酮类和非核糖体聚肽类化合物产生菌的筛选。 本研究通过对两对简并引物I-PKS-K1F/I-PKS-M6R,NRPS-A3F/NRPS-A7R,在基因水平上对从土壤中分离的50株放线菌进行靶向筛选,从基因水平上推测是否具有产生聚酮类和非核糖体聚肽类次级代谢产物的能力,以期发现新的天然聚酮类或聚肽类化合物,或其新的产生菌。50株放线菌中,Ⅰ型聚酮合酶阳性菌株有23株,阳性率为46％;非核糖体肽合成酶阳性菌株占Ⅰ型聚酮合酶阳性菌株74％,共17株。利用MTT法体外检测这17株阳性菌株抗肿瘤活性,其中,1044和1128两株菌株具有强烈的抗肿瘤活性。利用染色体步移技术对菌株1044已知聚酮合酶上下游未知序列进行扩增,得到包括Ks-AT序列在内的2405bp碱基。在未知化合物结构尚未鉴定之前,这种方法可以用来获取聚酮合酶基因簇相关信息。利用插入失活技术阻断1044菌株KS-AT序列,破坏1044菌株内聚酮合酶的生物合成途径,通过野生菌株和突变菌株发酵代谢产物的比对,从而确定了野生菌中聚酮合酶负责合成的代谢产物,为下一步分离纯化该聚酮化合物提供了靶标。本文通过分子生物学以及传统分类学方法,对2株阳性聚酮合酶和非核糖体肽合成酶菌株1044和1128进行了鉴定。同时,利用UPLC-MS/MS和NMR方法对上述菌株发酵产物进行分析。结果显示:1044初步鉴定为小小链霉菌,且其代谢产物经UPLC-MS/MS分析能够产生聚肽化合物放线菌素D;菌株1128初步鉴定为淀粉酶产色链霉菌,对其一种代谢产物分离纯化,结合氢谱和碳谱等数据,鉴定该产物为聚酮类化合物Aurodox。