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紫草是传统的中药材,其根能产生多种次生代谢物,含多种萘醌类化合物——紫草宁及其衍生物,这类物质具有很高的药用价值,具有抗炎、抗肿瘤、杀菌抗病毒、保肝和免疫调节等作用。其色素也是名贵的染料,可添加到化妆品等印染工业中使用。由于自然资源比较缺乏,人工种植难度大,紫草在市场上供不应求,为了解决紫草市场的供需矛盾,日本首先建立了紫草的两阶段培养体系,实现了紫草宁的大量人工合成,这些体系的建立,为紫草宁合成机制的研究提供了可能。紫草宁的合成受物理,化学,生物因子的影响,其中光起到决定性的作用,白光能够完全抑制紫草宁的积累。目前紫草宁合成途径中的部分酶的基因在不同光质处理下的表达已被研究,但是由于其复杂的合成途径和次生代谢调控途径,只对单基因的克隆研究远远不能够满足这一系统的研究,其受光调控的机理仍然不清楚。
本研究运用SMART法构建了滇紫草培养细胞的cDNA全长文库,并进行了质量鉴定。通过蓝白斑筛选鉴定了该库的库容量为1.4×106 pfu/ml,重组率为99.6%。PCR扩增条带单一,片段长度在1.0kb-1.5kb之间,平均长度约为1.2kb。插入片断较大,符合一般文库构建的标准。并且扩增得到了已知滇紫草中的PAL1、C4H2、4CL1、HMGR、LePGT1、LeDI2基因,这说明该文库的确包含与紫草宁合成相关的基因,这也暗示了该文库能够为鉴定其他与紫草宁合成相关基因提供重要资源。以上这些结果表明该文库具有高滴度、高重组率和比较大的插入片断,充分说明我们构建的滇紫草培养细胞cDNA全长文库是高效的,可满足进一步的筛选工作。随机挑取的85个克隆测序及ESTs分析表明,发现一条线粒体DNA序列,有7条ESTs序列是重复的,只有一条序列长度是小于150bp,剩下76条是非重复克隆。对这76个克隆的全长分析表明78.33%的片段包含全长编码区,这些序列中包括许多含有开放阅读框架的新基因,这些数据无疑丰富了滇紫草数据库,加快了运用遗传学手段对滇紫草研究的进程。这76个克隆的芯片杂交结果显示:23个是受光下调的基因,其中17个基因的功能是已知的,2个基因的功能是不确定的,4个是新基因。3个基因是受光上调的。三类受光下调的基因与紫草宁这类次生代谢物的合成具有密切的联系,包括编码核糖体蛋白、病原相关基因转录激活因子以及ARD类似蛋白基因。本文对这三类基因进行了具体的分析,为揭示光调控滇紫草细胞次生代谢物的合成机制奠定基础。