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背景：肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，是导致死亡的主要原因。小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）是支气管肺癌中未分化癌分型，约占全部肺癌的15％。由于较早发生较强的侵袭性和早期发生血行转移及淋巴转移，预后极差。小细胞肺癌的治疗以放化疗为主，虽然早期对一线化疗方案（足量EP方案:依托泊式或伊立替康+顺铂/卡铂）敏感，但由于极易出现多药耐药(multidrugresistance，MDR)现象而导致治疗失败。MDR导致的小细胞肺癌复发率很高，临床预后差，因此，多药耐药已成为近年来小细胞肺癌临床治疗急需解决的重要问题之一。课题组通过基因表达谱芯片对小细胞肺癌耐药细胞H69AR和非耐药细胞H69中21，522个基因进行分析，结果发现H69AR细胞中包含促泌素(SCGN)在内的1252个基因表达上调，1131个基因表达下调，免疫组化发现SCGN在小细胞肺癌组织中的表达较正常肺泡上皮的表达增高。促泌素(Secretagogin，SCGN)是新近发现的一种新型的EF钙结合蛋白，包含6个并行的EF-hand钙结合结构域，属于钙结合蛋白感受器家族。近年的研究显示，SCGN为一种神经内分泌标记物，除在正常神经内分泌组织和脑组织中有表达外，在神经内分泌源性肿瘤中也呈高表达，如具有神经内分泌功能的胰腺癌，前列腺癌，肾上腺瘤，垂体腺瘤和结肠癌以及一些类癌和类癌转移的肿瘤。虽然最近的研究表明，EF钙结合蛋白参与多种细胞生物学过程，包括细胞周期调控、增殖、凋亡、转录和分泌调节等过程。然而，据我们所知，SCGN在小细胞肺癌耐药性中的作用目前国内外尚未见相关研究。miRNAs是近年来在真核生物中发现的一类由18-24个核苷酸组成的非编码RNA，代表了一个新层次的基因表达调控方式，为癌症分子机制的研究提供了新的机遇。主要通过转录抑制或降解转录产物在转录和转录后水平调节靶基因的表达。大约50％得到注解的miRNA在基因组上定位于与肿瘤发生相关的区域和脆性位点，可能发挥着癌基因和抑癌基因的双重作用。miRNA在多种正常组织与癌组织之间的差异表达谱，表明miRNA在影响肿瘤的分类和疗效预测中发挥着重要的作用。越来越多的研究表明miRNA在调节肿瘤细胞对抗肿瘤药物耐药方面发挥着重要作用，如miR-21，miR-195，miR-455-3p和miR-10a与胶质瘤的发生、发展和多药耐药密切相关。而miR-128-2，miR-494的表达与非小细胞肺癌细胞耐药性的形成有关。我们采用miRNA芯片比较分析小细胞肺癌耐药细胞H69AR和非耐药细胞H69中miRNAs的表达谱差异性，结果发现miR-494在SCLC多药耐药株H69AR中的表达较敏感细胞株H69中降低，然而关于miR-494在小细胞肺癌多药耐药中的作用及其分子机制，目前尚未见相关报道。进一步通过生物信息学分析发现促泌素(SCGN)可能是miR-494的潜在靶基因之一。
目的：探讨miR-494与SCGN在小细胞肺癌多药耐药中的作用及其相互关系，进一步丰富小细胞肺癌耐药的分子机制，为小细胞肺癌耐药的研究提供依据，为解决临床棘手的小细胞肺癌耐药问题提供一种新策略。
方法：①收集2008.1至2011.8间在南方医科大学附属珠江医院接受治疗的77例小细胞肺癌石蜡包埋标本和42例SCLC患者化疗前后血液标本，组织标本为小细胞肺癌纤维支气管镜检查及活检组织，经病理学检查确诊为小细胞肺癌，所有组织标本患者均尚未接受放化疗治疗，血液标本为患者化疗前后的标本。本研究经珠江医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。②人小细胞肺癌敏感细胞株NCI-H69和耐药细胞株NCI-H69AR均购自美国ATCC。分别采用含10％和20％胎牛血清和青链霉素双抗的RPMI1640培养基，在37℃，5％CO2、饱和湿度的条件下传代培养，细胞生长状态良好时用于实验。实验前耐药细胞株至少在不含药物的培养基中培养2周。③细胞瞬时转染:采用阳离子脂质体法进行，miR-494模拟物、抑制剂、阴性对照(miRNA的转染量均为100nmol/L)、SCGN的小干扰RNA(siRNA)和阴性对照(siRNA的转染量均为60nmol/L)。操作按LipofectamineTM2000试剂说明书进行。稳定转染:采用LipofectamineTM2000将表达SCGN的SCGN-eGFP-N1-1载体及其空载转染入NCI-H69细胞，通过G418筛选阳性转染子进行扩大培养，获得稳定表达SCGN的细胞株。④总RNA，包括miRNAs，按照试剂说明书，通过TRIZOL或miRNA提取试剂盒从细胞及血液标本中提取。取上述RNA进行逆转录和实时荧光定量PCR。逆转录反应参照AMV逆转录试剂盒说明，PCR反应在实时定量PCR反应仪上进行。miRNA特异性的逆转录序列及内参U6参照miRNAs qRT-PCR试剂盒说明。 GAPDH和U6 snRNA作为内参三次独立实验后得到的数据运用公式RQ=2-△△Ct的方法进行分析。⑤抽提细胞总蛋白，采用BCA法进行蛋白浓度测定，然后12％SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、显影及定影，蛋白相对表达强度采用Quantity One软件进行定量。⑥细胞以5×103/孔接种于96孔板中;瞬时或稳定转染培养24小时后加入顺铂(DDP)、足叶乙甙(VP-16)及阿霉素(DOX)3种化疗药物，继续常规培养24h;每孔加新鲜配制的CCK8溶液10ul，37℃、5％CO2下继续培养4h后，终止培养。选择450nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，取每4个重复孔的光吸收值（A值）的平均值，计算各种转染细胞在3种化疗药物不同浓度下的存活率;细胞存活率=（实验组A值-空白对照组A值）/（阴性对照组A值-空白对照组A值×100％。重复实验三次，取平均值，以细胞存活率为纵轴，药物浓度对数为横轴作半对数图，并按作图法求出3种药物的IC50值。⑦采用流式细胞术分析细胞周期和凋亡，细胞转染24小时后，收集细胞行细胞周期和凋亡检测。细胞凋亡采用AnnexinV/PI检测试剂盒。细胞周期检测采用70％乙醇4℃固定16h，然后用PI染色后进行流式细胞仪测定。⑧将荧光素酶报告基因载体瞬时转染24h后，将细胞裂解，然后利用G1oMaxTM96 Microplate Luminometer发光检测仪分别测定Firefly luciferase和Renilla luciferase活性。共转pRL-SV40质粒作为内对照用来校正转染效率以Firefly luciferase与Renilla luciferase活性的比值作为荧光素酶的相对活性，进行不同样品间的比较。⑨将石蜡切片进行脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、抗体孵育、DAB显色、复染、透明、封片等步骤进行，免疫组化的检测结果进行半定量判定。随机选取5个高倍视野，如果核阳性的肿瘤细胞数超过50％，则认为该样本阳性。然后，按照细胞染色强度进行评分:棕褐色3分，棕黄色2分，淡黄色1分，无着色0分。⑩所有结果均经SPSS13.0统计软件进行分析。所有数据以均数±标准差（(x)±s）表示，两样本比较计数资料用x2，计量资料采用t检验。实时定量PCR、westernblotting、凋亡及周期实验、荧光素酶活性测定实验进行方差分析前进行方差齐性检验，方差齐采用one-way ANOVA，方差不齐采用近似F检验Welch法;组间两两比较前均先进行方差齐性检验，方差齐性采用LSD法，方差不齐的多重比较采用Dunnetts T3法。CCK8采用两因素析因设计的方差分析，多重比较用SNK法。同一组内不同浓度问比较和同一浓度不同组间比较用one-wayANOVA。参数比较前均先进行方差齐性检验，若方差不齐用基于方差不齐的近似F检验Welch法。SCGN表达与临床病理特征的关系分析采用Chi-Square检验。免疫组化染色强度的比较采用Mann-Whitney U检验;小细胞肺癌组织中SCGN表达与生存率的关系采用Kaplain-Meier分析。小细胞肺癌血液标本中miR-494和SCGN表达水平的相关性分析采用Spearman相关系数，同一患者化疗前后血液标本中miR-494和SCGN的差异表达采用重复测量设计的方差分析进行分析，各实验至少独立重复3次，重复性好，P＜0.05表示差异有统计学意义。
结果：⑴SCGN阳性表达位于胞浆，正常肺泡上皮细胞呈阴性表达。77例SCLC组织中，SCGN呈阳性表达有41例，阳性表达率为53.24％(41/77);SCGN阳性表达率与患者的年龄（x2=0.001，P=0.074）和性别（x2=1.313，P=0.821）无关，差异无统计学意义。在局限期(LD)患者中，24例SCGN呈阳性表达，阳性表达率为40.7％(24/59)，在广泛期(ED)患者中的阳性表达率为94.4％(17/18)，两者的SCGN阳性表达率差异具有统计学意义（x2=13.929，P＜0.001）。SCGN在存活患者中的阳性表达率为4.545％(1/22)，在死亡患者中的阳性表达率为29.091％(40/55)，两者的SCGN阳性表达率差异具有统计学意义(x2=13.929，P＜0.001)。⑵采用Kaplan-Meier法估计患者生存时间，结果发现男性患者与女性患者的生存时间无统计学意义(x2=1.255，P=0.263);不超过55岁的患者与长于55岁以上患者生存时间无统计学意义（x2=2.049，P=0.152）;局限期患者的生存时间长于广泛期患者，差异具有统计学意义(x2=66.622，P＜0.001);SCGN阴性患者的生存时间长于阳性患者，差异具有统计学意义(x2=56.641，P＜0.001)。Cox回归分析患者的性别、年龄、疾病分期及SCGN表达与患者预后的关系，发现疾病分期和SCGN可作为独立的预后因子(W=30.173，P＜0.001)，广泛期患者的相对危险险度5.713，95％相对危险度的可信区间为2.563-12.732，差异具有统计学意义(W=18.167，P＜0.001);SCGN阳性表达的相对危险度为10.569，95％相对危险度的可信区间为4.557-24.513，差异具有统计学意义(W=30.173，P＜0.001)。⑶SCGN在耐药细胞株H69AR中的表达均高于敏感细胞株H69，差异具有统计学意义(P＜0.001)。⑷将SCGN siRNAs（(SCGN-289，-395，-773)）和NC转染入H69AR细胞，下调SCGN的表达，提取总RNA和总蛋白，采用实时荧光定量PCR和Western Blot检测SCGN mRNA和蛋白的表达，结果提示SCGN-773和-395的mRNA表达均低于其他各组，SCGN-773的蛋白表达低于其他组。因此，选择抑制效果最好的SCGN-773进行后续实验。⑸降低SCGN表达可显著增加细胞对化疗药物ADM、DDP和VP-16的敏感性，降低细胞的生存率及IC50值，细胞凋亡增加，抗凋亡蛋白BCL2的表达降低，细胞周期发生G0/G1和S阻滞。相反通过转染SCGN-eGFP-N1-1，上调SCGN的表达，可增加细胞对化疗药物ADM、DDP和VP-16的敏感性，增加细胞的生存率，提高IC50值，细胞凋亡减少，细胞周期发生G2/M期阻滞，抗凋亡蛋白BCL2的表达增加，差异均有统计学意义(P＜0.001)。⑹采用miRNA芯片和基因表达谱芯片完成小细胞肺癌耐药细胞表达谱分析，并应用实时荧光定量PCR验证筛选得到的差异表达基因，miRNA芯片分析结果显示，相对于非耐药细胞H69，61个miRNAs在耐药细胞H69AR中出现表达异常，其中miR-494等37个miRNAs表达下调，而miR-195等24个miRNAs表达上调，结合cDNA和miRNA芯片结果分析发现，miR-494和SCGN在H69AR细胞中的表达具有反向关系。实时定量PCR提示miR-494在H69AR细胞中的表达及H69细胞下调8.87倍，进一步验证了芯片的结果。⑺为了进一步证实miR-494影响内源性SCGN的表达，我们分别将miR-494模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)转染至细胞，上调和下调细胞中miR-494的表达水平，观察SCGN的表达，结果提示，增加miR-494在H69AR细胞中的表达可降低SCGN的表达，同时增加细胞对化疗药物ADM、DDP、VP-16的敏感性。抑制miR-494则作用相反。结果进一步证实miR-494对SCGN的靶向调控作用。⑻为了进一步检测miR-494对SCLC化疗耐药性的影响，利用miR-494相应的模拟物或抑制物分别处理耐药细胞H69AR，结果显示增加miR-494的表达，能增加H69AR细胞对化疗药物顺铂、依托泊甙、阿霉素的敏感性，相反，降低miR-494的表达，可降低H69AR细胞对上述化疗药物的敏感性。⑼利用miRNA靶基因预测软件(PicTar, TarScan和miRBase)分析发现，miR-494与SCGN3-UTR具有互补结合位点，提示miR-494对SCGN可能具有靶向调节作用。⑽荧光素霉实验证实了miR-494与SCGN的靶向调控作用。⑾在以上研究基础上，我们通过基因功能失去和获得性实验发现，过表达SCGN能逆转miR-494引起的耐药抑制作用，增加细胞的化疗耐药性。再次证实了miR-494与SCGN的靶向调控关系。⑿为了进一步验证miR-494和SCGN在SCLC耐药中的临床意义，收集42例小细胞肺癌耐药患者的化疗前后血液标本，通过QRT-PCR对患者血液标本中miR-494及SCGN的表达水平进行检测，发现化疗前患者的血液标本中miR-494的表达水平增高，SCGN表达降低，对同一组小细胞肺癌患者血液标本中miR-494和SCGN mRNA的表达水平进行了相关性分析，结果发现在小细胞肺癌患者血液标本中miR-494和SCGN mRNA的表达呈负相关(r=-0.562，P＜0.001)。此外，我们还对其中7例接受3次化疗后产生耐药性的患者化疗前后血液标本中miR-494及SCGN的表达进行重复测量分析发现，随着化疗次数的增加，miR-494的表达水平逐渐降低，SCGN表达逐渐增高，差异有统计学意义(F=24.650，49.224;P均小于0.001)。该结果从人群水平进一步验证了miR-494与SCGN基因的靶向调控作用。
结论：①SCGN在SCLC组织和血液标本中表达。SCGN的表达与SCLC患者的临床分期和总生存率相关，而与患者的性别和年龄无关。SCGN可能作为SCLC独立的预后因子。②SCGN在多药耐药细胞株中呈高表达，下调SCGN的表达可增加细胞对化疗药物ADM、DDP、VP-16的敏感性，SCGN在SCLC血液标本中的表达水平，与化疗敏感性相关。SCGN参与SCLC多药耐药可能是通过影响细胞的凋亡和周期实现的。③荧光素霉实验及体内实验证实SCGN是miR-494的靶基因之一，miR-494通过靶向作用于SCGN的表达，进一步影响小细胞肺癌的多药耐药。