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猪圆环病毒2型(PCV2)与猪群中发生的多种疾病相关,包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、先天性震颤(CT)等,已经给全世界养猪业带来了很大的经济损失。ORF2基因是PCV2的重要抗原基因,编码病毒的衣壳蛋白(Cap蛋白),在Cap蛋白上存在抗原表位,有较强的免疫原性,基因序列保守,因此ORF2基因成为建立PCV2特异性血清学检测方法及疫苗研究的目的基因。猪白细胞介素4(PoIL-4)具有广泛的生物学功能,尤其是可作为疫苗佐剂特异性地增强机体免疫应答,从而降低疫苗的副反应,使机体获得更有效的保护。因此构建猪PCV2-ORF2和PoIL-4重组亚单位疫苗对控制猪PCV2病的发生具有重要意义。
设计含KpnI和SacII双酶切位点的多条引物,并采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术将PCV2的ORF2全长基因和猪白介素4(PoIL-4)阅读框基因串联成PCV2-ORF2-1inker-PoIL-4基因（简称OLI基因）(linker为含15个氨基酸的柔性多肽(Gly4Ser)3)并克隆入pMD18-T Simple克隆载体；筛选含OLI基因的阳性克隆质粒,经限制性内切酶KpnI和SacII双酶切后连接入经相同酶切的pPICZaC真核表达载体中以构建重组表达质粒pPICZaC-OLI,同理构建真核表达质粒pPICZctC-OR、pPICZaC-IL4。经KpnI和SacII双酶切鉴定。阳性重组质粒送公司测序鉴定。
阳性重组表达质粒pPICZaC-OLI经限制性内切酶SacI线性化,电击转化毕赤酵母X-33感受态细胞,涂布YPDS+ZeocinTM选择性培养基筛选阳性重组菌。通过提高抗生素浓度,筛选出具高抗性的转化子pPICZaC-OLI/X-33。同理按此法构建并筛选出pPICZaC-OR/X-33、pPICZαC-IL4/X-33以及空载体pPlCZetC转化酵母菌pPICZaC/X-33)。阳性菌在BMMY培养基中进行甲醇诱导表达,诱导表达3d后,收集菌液,离心,取上清。取少量上清液进行SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。利用Cap-linker-PolL-4、Cap蛋白构建PCV2重组亚单位疫苗,分别对小鼠进行免疫接种,采用ELISA方法检测PCV2抗体以评价其免疫效果。
结果表明：成功构建了共表达重组质粒pPICZaC-OLI及其单表重组表达质粒pPICZaC-OR、pPICZaC-IL4,分别在毕赤酵母X-33中成功分泌表达,蛋白大小分别约为48kD（Cap-linker-PolL-4）、32kD(Cap)、18kD(PolL-4)。表达的嵌合蛋白Cap-linker-PoIL-4可分别与抗PCV2抗体和抗IL-4抗体发生特异性免疫反应,Cap-linker-PoIL-4蛋白具有Cap蛋白和PoIL-4双重免疫反应活性。利用Cap-linker-PoIL-4、Cap蛋白构建PCV2重组亚单位疫苗,免疫小鼠后可诱导小鼠产生明显的抗PCV2抗体,第3次加强免疫后,Cap-linker-PoIL4蛋白免疫组抗体滴度最高,是空白对照组的3倍,且显著高于Cap蛋白免疫对照组,说明表达的Cap-linker-PoIL4融合蛋白中的PoIL4蛋白对Cap-linker-PoIL4融合蛋白在小鼠体内的免疫起到了很好的免疫增强作用。
本研究成功构建了PCV2-ORF2-1inker-PoIL-4嵌合基因及其重组表达质粒pPICZaC-OLI;重组表达质粒在毕赤酵母X-33细胞中表达了具有Cap蛋白和PoIL-4双重免疫反应活性的融合蛋白,免疫小鼠后可诱导小鼠产生高的抗PCV2抗体。本研究为PCV2的基因工程重组亚单位疫苗的研究奠定了重要基础。