论文部分内容阅读
细菌鞭毛不仅在适应环境、寻找营养和躲避不良因素伤害等过程中是一种重要的运动器官，而且在趋化、附着、毒性因子产生、生物膜形成和定殖等过程中也是一种潜在的致病因子。细菌鞭毛的生物合成受到级联调控系统的严格控制。在一些重要的动物和医学病原细菌(如铜绿假单胞、霍乱弧菌和幽门螺旋杆菌等)中，存在一个以转录调控因子FleQ和σ54因子RpoN为主控因子的4层级联调控系统，FleQ和σ54因子协同调控了不同类型鞭毛基因的表达。
水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv．oryzae，简称Xoo)侵染引起的白叶枯病是世界水稻生产上最严重的细菌病害之一，也是病原物一植物互作研究的一种重要模式系统。Xoo单根极生鞭毛是重要的运动器官和潜在的致病因子。然而，至今对Xoo鞭毛生物合成的调控机理尚不清楚。对Xoo基因组进行生物信息学分析，发现了由大约60个基因组成了鞭毛基因簇，其结构排列、序列特征、转录单元和转录方向与铜绿假单胞等相似，其中存在FleQ和RpoN同源序列FleQxoo和RpoNxoo。推断Xoo可能同样存在一个以FleQxoo和RpoNxoo为主控因子的级联调控系统。
本研究通过基因克隆、序列分析、缺失突变、表型测定、鞭毛基因和TTSS基因表达检测，对FleQxoo和RpoNxoo的分子特征及其功能进行了鉴定分析。研究目的和意义在于阐明FleQxoo和RpoNxoo在Xoo鞭毛运动性以及相关生物学性状表达中的作用；阐明Xoo鞭毛系统调控机制将为发展新型、有效和可持续的病害控制策略和方法提供科学依据。
以Xoo野生型菌株PXO99A基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，成功地获得了与GenBank中KACC10331序列完全一致的fleQxoo(1485bp)和rpoNxoo(1402bp)基因片段。FleQxoo是NtrC家族激活蛋白成员之一，具有与σ54作用的结构域和DNA结合保守结构域(HTH)，通过结合靶基因启动子区域、激活基因的转录。RpoNxoo具有与激活子互作的结构域(AID)、核心结合结构域(CBD)和DNA结合结构域(DBD)的3个保守结构域。FleQ和RpoN在植物病原黄单胞菌(水稻白叶枯病菌、柑桔溃疡病菌、番茄斑点病菌、甘蓝黑腐病菌)中同源性较高，氨基酸序列同源性可达到81.06-98.08％。
采用基因标记置换方法，将构建的基因缺失突变载体pKS-fleQG和pKS-rpoNG分别导入PXO99A，发生同源重组和标记双交换，分别从基因组中缺失了fleQxoo和rponxoo，获得了△fleQxoo和△rpoNxoo缺失突变体。将构建的互补载体pHM-fleQ和pHM-rpoN分别转化到相应的突变体中，获得了互补菌株△fleQxoo∷C和△rpoNxoo∷C。
与PXO99A相比，△fleQxoo、△rpoNxoo和△fleQxoo+△rponxoo鞭毛产生能力丧失，运动性减弱，基因互补可以使之恢复；但胞外酶类(纤维素酶和木聚糖酶)活性以及对烟草叶组织的致敏性无明显改变。表明FleQxoo和σ54可能主要参与了Xoo鞭毛生物合成及其运动性的调控。
利用生物信息学方法，鉴定了44个σ54依赖型鞭毛基因，其启动子中存在σ54识别的保守结合域GG-(N10)-GC和FleQxoo结合位点保守序列CC-(N4)-C-(N3)-T。鉴定了3个σ28依赖型基因(fliCxoo，cheAxoo和cheZxoo)，其启动子中存在σ28识别的保守结合域TAAA-(N15)-GCCCGTT。利用RT-Q-PCR方法，检测△fleQxoo和△rpoNxoo中6个鞭毛基因(包括自身基因fleQxoo和rpoNxoo、σ54依赖型鞭毛基因fliAxoo、fliDxoo和fliLxoo、σ28依赖型鞭毛基因fliCxoo)的转录。与PXO99A相比，在所有突变体中这些鞭毛基因的表达均显著降低。表明FleQxoo和Rponxoo不仅直接正向调控了鞭毛基因fliAxoo、fliDxoofliLxoo的转录，通过FliAxoo(σ28)间接正向调控了鞭毛素基因fliCxoo的转录，而且还负向调控了自身基因fleQxoo和rpoNxoo的转录。
此外，利用RT-Q-PCR方法，检测了△fleQxoo和△rpoNxoo中3个TTSS基因(转录调控基因hrpG、hrpXo和效应子基因助hpaI)的转录。与PXO99A相比，在所有突变体中这些TTSS基因的表达均显著增加。表明FleQxoo和RpoNxoo负向调控了TTSS基因(hrpG、hrpXo和hpaI)的转录。
总之，本研究阐明了FleQxoo和RpoNxoo(σ54)作为主控因子，在Xoo鞭毛生物合成、运动性及其基因表达中起重要的调控作用，揭示了Xoo可能存在一个以FleQxoo和RpoNxoo(σ54)为一级调控因子、FliAxoo(σ28)为二级调控因子的鞭毛基因级联调控系统。