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卵巢癌是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的恶性肿瘤，在年龄介于55-74岁妇女所患的恶性肿瘤中，卵巢癌是第五位常见导致死亡的癌症。卵巢癌细胞具有较高的增殖及转移潜能，然而对其恶性生物学行为机制尚不明确。因此，研究卵巢癌的恶性生物学行为机制，寻找新的治疗靶点，成为亟待解决的任务。
目前认为，蛋白质的翻译后修饰是调控合成后蛋白质的定位、活性和功能的重要方式，在生物体中具有十分重要的作用。其中，小分子类泛素化修饰因子(smallubiquitin-like modifier，SUMO)在蛋白质间相互作用、DNA结合、信号转导、核质运输、转录因子激活等方面均发挥重要作用。SUMO从前体合成、水解活化、到共价结合底物蛋白质的过程涉及酶E1、E2、E3的级联反应。泛素结合酶9(Ubiquitin-conjugating enzyme9，Ubc9)是SUMO化中唯一的E2结合酶，在对底物的识别中起着不可替代的作用。有研究表明，Ubc9在许多肿瘤组织中高表达。例如，通过半定量RT-PCR研究发现Ubc9在卵巢癌组织中过表达，显性负性突变的Ubc9能显著降低人乳腺癌细胞MCF-7接种裸鼠后的肿瘤生长速度;有研究显示，Ubc9在乳腺癌，头颈部肿瘤和肺癌中存在高表达。
目前，关于Ubc9在卵巢癌中的作用及机制研究国内外鲜有报道。本课题旨在探讨Ubc9在卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为中的作用及可能机制。
方法：
一、免疫组化方法检测Ubc9在上皮性卵巢癌中的表达
应用免疫组织化学染色分析56例上皮性卵巢癌和10例正常卵巢组织中Ubc9蛋白的表达，并探讨其与上皮性卵巢癌临床分期、病理分级等临床病理参数之间的关系。
二、稳定高表达Ubc9卵巢癌细胞株的建立
1、用Real-time PCR、Western Blot方法检测Ubc9在HO8910、A2780和CAOV3三种不同卵巢癌细胞中的表达情况，选择内源性低表达Ubc9的卵巢癌细胞转染Ubc9表达载体。
2、Real-time PCR扩增Ubc9全长片段，于XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点连接pEGFP-N1载体，重组质粒经测序和双酶切验证。
3、利用Ubc9真核表达载体稳定转染HO8910细胞，得到阳性克隆用荧光显微镜和Western Blot方法验证Ubc9的表达。
三、调节Ubc9基因对卵巢癌细胞增殖及部分信号转导通路的影响
1、采用化学合成法，设计三条针对Ubc9基因的siRNA，转染至卵巢癌HO8910-Ubc9细胞48小时后，分别采用real-time PCR技术及Western Blot技术检测Ubc9基因和蛋白表达水平的变化，筛选出干扰效果最好的Ubc9-siRNA以进行后续实验。
2、以HO8910细胞为对照，MTT法检测HO8910-Ubc9细胞增殖能力的变化;将Ubc9-siRNA转染至卵巢癌HO8910-Ubc9细胞后，采用MTT法检测HO8910-Ubc9细胞增殖能力的变化。
3、以PI3K特异性抑制剂LY294002作用于HO8910-Ubc9细胞，MTT法分别于第24h、48h、72h进行细胞增殖检测。
4、Western Blot方法检测转染Ubc9真核表达载体(pEGFP-N1-Ubc9)前后HO8910细胞内Akt和p-Akt蛋白水平的变化和转染Ubc9-siRNA前后HO8910-Ubc9细胞内Akt和p-Akt蛋白水平的变化。
四、调节Ubc9基因对卵巢癌细胞侵袭和迁移能力的影响
1、采用Transwell小室检测HO8910细胞转染pEGFP-N1-Ubc9后以及HO8910-Ubc9细胞转染Ubc9-siRNA后细胞侵袭能力的变化。
2、采用划痕法检测上调以及敲低Ubc9基因后卵巢癌细胞迁移能力的变化。
实验结果:
一、Ubc9在上皮性卵巢癌中的表达及与临床病理参数间的关系
Ubc9主要表达于上皮性卵巢癌细胞胞浆，很少见于胞核表达。Ubc9在上皮性卵巢癌组织中高表达，正常卵巢上皮组织中低表达，两者间比较差异有统计学意义。上皮性卵巢癌组织中Ubc9表达水平与卵巢癌的FIGO分期、分化程度、病理类型、手术后残余病灶体积之间无明显相关性。
二、建立Ubc9高表达HO8910卵巢癌细胞株
1、Real-time PCR和Western Blot结果显示，3种卵巢癌细胞中Ubc9的基因和蛋白表达水平A2780高于CAOV3高于HO8910。下一步选择内源性低表达Ubc9的HO8910细胞转染Ubc9表达载体。
2、成功构建pEGFP-N1-Ubc9真核表达载体，经测序和双酶切得到验证。
3、利用pEGFP-N1-Ubc9真核表达载体脂质体法转染HO8910细胞，得到11个转基因细胞克隆，荧光显微镜下观察阳性克隆并以Western Blot方法鉴定Ubc9表达。选择其中Ubc9蛋白表达水平较高的3、4、7、8号克隆进一步扩大培养用于后续实验。
三、Ubc9基因调节可能通过PI3K/Akt信号转导通路影响卵巢癌细胞的增殖
1、Real-time PCR结果显示:Ubc9-siRNA转染HO8910-Ubc9细胞48小时后，与对照组相比， siRNA1、2组Ubc9的mRNA表达水平均显著降低（P＜0.05）;siRNA3组Ubc9的mRNA表达水平与阴性对照组相比无明显差别(P＞0.05)。
2、Western Blot检测结果表明:与阴性对照组相比Ubc9-siRNA1、2、3组Ubc9的蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05)。
3、MTT法检测发现:HO8910-Ubc9细胞增殖能力显著高于HO8910细胞(P＜0.05);通过对转染后48小时及72小时的各组细胞进行MTT法检测发现:Ubc9-siRNA干扰组细胞增殖能力显著低于空白对照组和阴性对照组细胞(P＜0.05)。
4、MTT法检测发现:同对照组相比，以LY294002（25μmol/L）处理后的HO8910-Ubc9细胞于24，48及72小时增殖能力受到明显抑制，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
5、Western Blot检测结果表明:Ubc9过表达卵巢癌细胞(HO8910-Ubc9)中Akt磷酸化水平明显提高（P＜0.05），Ubc9基因沉默后，与对照组相比，HO8910-Ubc9细胞内Akt磷酸化水平明显下降(P＜0.05)。
四、Ubc9促进卵巢癌细胞侵袭和迁移能力
1、Transwell侵袭实验结果显示:HO8910-Ubc9组侵袭至滤膜下面的细胞数明显高于空白对照组和空质粒组（P＜0.05）。Ubc9-siRNAs转染48小时后，HO8910-Ubc9细胞的穿膜数明显低于对照组(P＜0.05)。
2、划痕试验结果显示:HO8910-Ubc9细胞于划痕后0、6、12、24小时愈合率均明显高于HO8910组，差异有统计学意义（P＜0.05）;转染Ubc9-siRNAs的HO8910-Ubc9细胞于划痕后24小时，细胞愈合率明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论:
1、Ubc9在上皮性卵巢癌组织的表达明显高于正常卵巢组织。
2、通过Ubc9重组真核表达载体建立稳定高表达Ubc9卵巢癌细胞株可以上调Ubc9在卵巢癌细胞中的表达，Ubc9-siRNA可以下调卵巢癌细胞中Ubc9 mRNA和蛋白的表达。
3、在卵巢癌细胞中，Ubc9过表达可以促进细胞增殖，调节Ubc9基因的表达可能通过PI3K/Akt信号转导通路发挥作用。
4、上调Ubc9表达可以促进卵巢癌细胞的侵袭和迁移;Ubc9-siRNA可以抑制卵巢癌细胞的侵袭和迁移。