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当妇女进入绝经期后,体内雌激素水平下降,由此引发一系列更年期综合征症状如骨质疏松、心血管疾病、潮热、失眠等症。目前临床上普遍采用雌激素替代疗法(HRT)来预防或治疗这些症状,然而激素替代治疗使用30余年来不断有高血凝、高血压、水肿等副作用的报道。由于HRT增加了乳腺癌及子宫内膜癌等妇科肿瘤的发病率,1999年美国国立卫生研究院己宣布将人工合成雌激素列入致癌“黑名单”。鉴于HRT的风险性,寻求雌激素的替代物,作用比较温和且具有双向调节作用的植物雌激素己成为研究的热点。
青娥丸(QingE formula)首载于宋代的《太平惠民和剂局方》,系补肾经典方剂,收载于《中华人民共和国药典》2010年版,由杜仲(盐炒)、补骨脂(盐炒)、核桃仁(炒)、大蒜四味药组成,方中杜仲为君,能补肝肾,强筋骨,用于肾虚腰痛,筋骨无力;补骨脂为臣,温肾助阳,用于腰膝冷痛;核桃仁为佐,滋补肝肾,健脾益气;大蒜为使,活血通络,交通心肾。本方补肾强腰,用于肾虚腰痛,起坐不利,膝软乏力,常服之,可壮筋骨、和血脉、乌鬓发、益颜色。祖国医学的补肾温阳法和现代医学的雌激素替代疗法是否有一定的相关性?青娥方是否具有雌激素样作用?若有雌激素样作用,那么它的机理是什么?在国内外尚无报道。
本论文采用未成熟动物、去卵巢动物、衰老动物分别模拟女性一生雌激素水平低下的三个生理阶段,进行体内雌激素活性评价;并采用MCF-7细胞模型及细胞和分子生物学的方法,针对雌激素受体(estrogen receptor,ER)通路开展作用机制的研究,以期揭示青娥方雌激素样作用的科学本质。
一、青娥方雌激素样作用和机理研究
采用未成熟小鼠、去卵巢小鼠、衰老大鼠三种动物模型来研究青娥方的雌激素样作用,体外机制采用雌激素受体阳性的MCF-7细胞株和转染ERE(estrogenresponse element)荧光素酶报告基因的MCF-7细胞和western blot研究雌激素受体亚型的影响。
1.青娥方3.4g/kg(相当于人的临床等效剂量)可使未成熟小鼠阴道细胞角化提前进入动情期,增加子宫湿重,提示青娥方具有雌激素样作用。
2.青娥方0.85g/Kg、1.7g/kg、3.4g/kg能恢复去卵巢小鼠的动情周期,拮抗去卵巢小鼠的子宫萎缩,增加子宫、肾上腺重量,增加子宫雌激素受体表达,升高血中E2,降低LH,提示其具有雌激素样作用。
3.青娥方0.5g/kg、2.0g/kg、可拮抗衰老造成的子宫、阴道、乳腺萎缩,可增加自然衰老大鼠子宫、肾上腺重量,增加血中E2含量,表现为雌激素样作用;同时2.0g/kg增加血中SOD含量,降低血中MDA含量表现为抗衰老抗氧化作用。
4.青娥方可以降低去卵巢小鼠肛温,提示其可能缓解围绝经期女性潮热症状。青娥方0.85g/kg、3.4g/kg能增加阈下剂量戊巴比妥钠小鼠入睡个数,延长阈剂量戊巴比妥钠小鼠睡眠时间,其可能改善女性的睡眠质量。
5.青娥方可有效的拮抗尼尔雌醇对未成熟小鼠的子宫增重作用,当体内雌激素水平低下时表现为雌激素样作用,体内雌激素水平高时表现为抗雌激素样作用,青娥方符合植物雌激素双向调节的作用特点,且青娥方并不像合成雌激素增加大鼠乳腺PCNA的表达,提示青娥方使用安全、有效。
6.体外实验研究表明,青娥方95％乙醇提取物能促进MCF-7细胞的增殖,能显著促进ERE报告基因荧光素酶表达,并能显著上调MCF-7细胞中ErαErβ的表达,且上述作用可被雌激素受体拮抗剂ICI1827,80阻断。
综上所述,青娥方体内发挥雌激素样作用可能通过三种途径:①直接表现为雌激素样作用;②增加靶器官的ER数量;③增强肾上腺皮质功能,促进肾上腺皮质分泌雌激素,同时作用于下丘脑体温调节中枢,降低体温。体外机制研究表明青娥方发挥雌激素样作用通过ER-ERE通路。
二、青娥方拆方研究
采用整体动物实验(未成熟小鼠)和体外实验(MCF-7细胞增殖实验)研究青娥方中单味药及各拆方雌激素样作用,揭示其配伍规律。
青娥方中杜仲、补骨脂可使未成熟小鼠子宫重量增加,使阴道细胞角化提前进入动情周期,促进未成熟小鼠靶器官的发育,而核桃仁、大蒜并未使未成熟小鼠子宫重量增加,表明君药杜仲、臣药补骨脂在方中发挥雌激素样作用。杜仲雌激素样作用最强,补骨脂活性次之,这符合它们在方中君臣药的地位。
当君臣药配伍使用,两药具有协同作用。当两药分别配伍核桃仁、大蒜时它们的雌激素样作用增强,配伍核桃仁作用强于配伍大蒜,杜仲与两药配伍应用效果优于补骨脂与两药配伍应用,也揭示杜仲在方中君药的地位
当君臣药分别与核桃仁、大蒜使用,配伍核桃仁的作用强于配伍大蒜,此结果也与核桃仁、大蒜佐使地位相符。
在青娥方各拆方组中尤以四味药联合使用的青娥方复方效果最佳,此结果也验证中医复方用药的科学性。
三、青娥方活性物质筛选及其作用机理研究
我们采用体内外实验相结合进行活性物质筛选,体内实验采用未成熟小鼠子宫重量实验进行青娥方活性部位筛选,体外实验采用经典的E-screen法进行杜仲、补骨脂中化合物体外活性筛选。对活性比较强、含量比较大的化合物进行未成熟小鼠和去卵巢小鼠拟雌激素样活性和作用机理研究。体外机制研究集中在活性化合物与ER binding、ERE结合位点、Ers、雌激素靶蛋白PR、细胞增殖方面的影响
1.采用未成熟小鼠子宫重量法对青娥方的水提取物、95％乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、120＃汽油提取物和人工胃肠液提取物进行活性部位筛选,发现除人工胃肠液提取物外各提取部位均能使未成熟小鼠子宫重量增加,其作用强弱顺序为95％乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物≥120＃汽油提取物＞水提取物,提示其脂溶性成分为其主要的雌激素活性部位。
2.采用E-screen法对黄酮类、香豆素类、木脂素类、萜类等23个化合物进行拟雌激素活性筛选,共筛选出中黄酮类的corylin(补骨脂异黄酮),bavachalcone(补骨脂查尔酮),isobavachalcone(补骨脂异查尔酮),Daidzin(大豆苷)4-hydroxylonchocarpin(异补骨脂色烯素),bavacoumestan C,bavachromene(补骨脂色烯素),Genistin(染料木苷),bavachinin(补骨脂二氢黄酮甲醚),bavachin(补骨脂二氢黄酮);香豆素类的isopsoralen(异补骨脂素),psoralen(补骨脂素),psoralidine(补骨脂定),1,2-dehydroisopsoralidin(1",2"-去氢异补骨脂定):木脂素类的pinoresinoldiglucoside(松脂醇二葡萄糖苷);萜类的bctulinol(白桦脂醇),eucornmio(杜仲醇)17种化合物具有雌激素样作用。
3.体内研究表明psoralen,corylin,psoralidine,bavachinin64mg/kg使未成熟小鼠提前进入动情期,增加子宫湿重促进生殖系统成熟,但血清E2浓度和子宫雌激素受体并未发生显著性改变。四个化合物均能拮抗去卵巢小鼠的子宫萎缩,增加子宫重量和子宫雌激素受体的表达。增加肾上腺重量,并增加血中E2含量,降低血中LH,降低肛温。综上psoralen,corylin,psoralidine,bavachinin发挥雌激素样作用可能通过三种途径:①直接发挥雌激素样作用;②增加靶器官的ER数量;③增强肾上腺皮质功能,促进肾上腺皮质分泌雌激素,同时作用于下丘脑体温调节中枢,降低体温。
4.体外机制采用ER阴性的MDA-MB-231细胞增殖、基因芯片、western blot、MOE-DOCK等方法研究活性化合物的ER通路机制。
4.1 MCF-7细胞基因芯片结果表明Corylin上调ERα1.61倍、ERβ1.27倍和PR1.25倍,提示其可能作用于ER通路发挥作用。
4.2 Corylin,Daidzin,4-hydroxylonchocarpin,bavacoumestan C,bavachromene,Genistin,bavachinin,bavachin,isopsoralen,psoralen,1,2-dehydroisopsoralidin,pinoresinoldiglucoside,betulinol,eucommio均不能促进MD-MBA-231细胞增殖,因此推测各活性化合物可能通过ER途径发挥雌激素样作用,而bavachalcone、isobavachalcone、psoralidine促进该细胞的增殖,提示它们除通过ER通路外可能还通过其它通路发挥作用。
4.3 Corylin,psoralidine,eucommiol,isobavachalcone,bavachalcone,pinoresinoldiglucoside,psoralen,bavachalcone,isobavachalcone,psoralidine bavachin显著促进MCF-7细胞增殖,其作用强弱顺序为corylin≈psoralidine＞eucommiol＞iSobavachalcone＞bavachalcone≈pinoresinoldiglucoside＞bavachin＞isopsoralen≈psoralen≈bavachinin。其中除bavachalcone,isobavachalcone和psoralidine外其增殖作用可以被雌激素受体拮抗剂ICI1827,80拮抗,表明它们发挥雌激素样作用可能通过ER通路,而psoralidine bavachalcone、isobavachalcone100μM均能显著促进MDA-MB-231细胞的增殖,且三者促进MCF-7增殖作用不能被ICI1827,80拮抗,再次证明此三种化合物促进MCF-7细胞增殖不仅通过ER通路,亦有其它通路参与。
4.4 MOE-Dock软件计算活性化合物和Ers的结合,除psoralen和isopsoralen与ER两种亚型有较弱的结合外,其它活性化合物同17β-estrodiol相似与Erα、Erβ均有较强的结合能力,它们的Erα binding/Erβ binding为psoralidine＞corylin＞isobavachalcone≈pinoresinol diglucoside＞bavachalcone≈bavachin≈psoralen＞isopsoralen=bavachin＞eucommiol。Erα介导细胞增殖,而Erβ抑制细胞增殖,Erα binding/Erβ binding强弱顺序与促进MCF-7细胞增殖强弱顺序基本一致。以corylin和psoralidine的Erα binding/Erβ binding值最大,此两个化合物促进MCF-7增殖活性最强。
4.5 Corylin、psoralidine、eucommiol、isobavachalcone、bavachalcone、pinoresinoldiglucoside、psoralen、isopsoralen、bavachin、bavachinin均能显著促进转染ERE报告基因的MCF-7细胞荧光素酶表达并表现为剂量依赖关系,在10-5M时其作用强弱顺序为corylin＞isobavachalcone＞psoralidine＞bavachin＞psoralen≈bavachalcone≈pinoresinoldiglucoside＞eucommionl＞isopsoralen＞bavachinin.雌激素受体拮抗剂ICI1827,80能显著拮抗化合物诱导的荧光素酶表达;提示各化合物发挥雌激素样作用是通过ER-ERE通路启动一系列激素依赖性生理生化进程。
4.6 Corylin,psoralidine,psoralen,bavachinin显著上调MCF-7细胞中Erα、Erβ及雌激素敏感蛋白PR的表达,且黄酮类作用强于香豆素类,且此上调作用能被ICI1827,80阻断。表明活性化合物对PR蛋白的上调亦是通过ER通路发挥作用。
综上corylin、isobavachalcone、psoralidinc、bavachin、psoralen、bavachalcone、pinoresinoldiglucosidc、eucommionl、isopsoralen、bavachinin发挥雌激素样作用是通过和ER结合,化合物-受体复合物进入细胞核内实现二聚化,二聚体与DNA上特异的核苷酸序列(ERE)结合,即ER-ERE通路,启动一系列激素依赖性生理生化过程。其中isobavachalcone、bavachalcone、psoralidine还通过其它通路发挥雌激素样作用。
本论文证明祖国医学补肾温阳和现代医学的雌激素替代疗法具有一定的相关性,首次发现了经典补肾名方青娥方的新功用一雌激素样作用,并揭示了其作用机理;阐述了青娥方的方药配伍规律;明确了青娥方发挥雌激素样作用的药效物质基础及其作用机理。全面的揭示了青娥方雌激素样作用的科学本质并为青娥方治疗围绝经期综合征提供了科学依据。