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纳豆激酶（Nattokinase）是从日本传统食品纳豆中提取出来的一种具有溶血栓作用的酶。1987年由日本的须见洋行等首先发现。比之目前常用的治疗心脑血管栓塞疾病的药品如链激酶、尿激酶、重组组织型纤溶酶原激活剂、对-甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活剂复合物和尿激酶原等，纳豆激酶具有安全性好、易被人体吸收、作用直接迅速、作用持续时间长、造价低廉等优点，可作为一种很有前景的新型药物予以开发。本研究利用基因重组技术，将纳豆激酶基因分别在大肠杆菌与毕赤酵母中实现了表达，得出如下结果： 首先根据已知的纳豆激酶基因序列及原核表达载体pBV220的性质，设计引物，通过对PCR反应条件的优化，得到PCR扩增纳豆激酶基因的优化条件为：染色体基因组10ng左右，Mg2+浓度1.5mmol／L，退火温度60℃。反应时间参数为：95℃热启动变性3min，然后进入循环：94℃，1min，60℃，1min，72℃，3min，30个循环结束后，72℃，15min。在这种优化程序下进行PCR反应，获得了特异、高效和忠实的纳豆激酶基因产物。 成功地构建了pUC19-T载体，并克隆到PCR产物，克隆产物经过单酶切、双酶切、PCR分析及序列测定，证明克隆到pUC19-T载体上的外源基因的即为纳豆激酶基因。 将重组质粒pUC19-NK上的纳豆激酶基因成功克隆到表达载体pBV220上，并将之转入大肠杆菌HB101中，得到转纳豆激酶基因工程菌，提取重组质粒经单酶切、双酶切及PCR分析验证后，对重组菌的生长及表达进行一系列研究，结果表明：外源纳豆激酶基因的导入对宿主的生长没有明显的影响：重组质粒的稳定性实验表明：该质粒具有良好的分离稳定性，而结构稳定性较差。表达动态研究表明：转基因工程菌在30℃培养6h后，在42℃诱导5h，外源基因可以获得较高的表达，发酵上清液中酶的表达量相当于120U／mL菌液。SDS-PAGE分析结果表明：该酶基因的表达产物可以分泌到细胞外，胞外酶表达量占菌体蛋白的12％左右。 为了进一步提高外源基因的稳定性及表达量，将纳豆激酶基因克隆到毕赤酵母中进行研究。根据已知的纳豆激酶基因序列及载体pPICZαA的性质设计PCR反应的引物，通过适当调整PCR反应的退火温度，以纳豆杆菌染色体组DNA