斑鳢弹状病毒的分离、鉴定及灭活疫苗的制备

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本研究从患病的斑鳢肝、脾、肾病灶组织中分离到1株弹状病毒,编号为GC100906。将组织过滤液回归感染健康斑鳢均能显示与自然发病鱼相似的症状,死亡率达100%。通过对该病毒的形态特征、理化特性、最适增殖温度、敏感细胞及基因扩增序列分析等方面进行了研究。结果发现:组织液接种FHM、EPC、CIK、PSF细胞后,盲传至第3代可在FHM、EPC细胞上可观察到明显的细胞病变(CPE),主要表现为细胞收缩、变圆,脱落。将接种FHM细胞制备成超薄切片,透射电镜下观察可见细胞质中存在大量病毒颗粒,呈典型的子弹状,直径约53nm,长度为140nm。该病毒在FHM细胞上的最适增殖温度为28℃。理化特性测定结果表明该毒株不耐热,对脂溶剂、酸和碱敏感,表明该病毒有囊膜;DNA抑制剂IUDR处理病毒后接种FHM细胞病毒滴度几乎没有改变,表明该病毒是RNA病毒。参考OIE《水生动物疾病诊断手册》(2006)中的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、蛇头鱼弹状病毒(SHRV)的引物及本实验室根据鳜鱼弹状病毒(SCRV)N基因的保守序列设计的特异性引物对斑鳢弹状病毒的基因组RNA进行RT-PCR扩增,SCRV能扩增出大小约400 bp的片段。将该片段克隆、测序后,与GenBank中VHSV、SHRV、狂犬病毒(RV)、牙鲆弹状病毒(HIRRV)、SVCV、SCRV、IHNv的序列进行BLAST比对并构建系统进化树,结果表明,该基因序列与SCRV聚为一支,同源性为94%。由于该病毒与SCRV存在一定差异,暂将其命名为斑鳢弹状病毒(Channamaculata rhabdovirus,CHRV)。  将分离的GC100906毒株接种FHM细胞,测得病毒滴度为107.64TCID50/0.1mL。将病毒液用终浓度为0.2%的甲醛溶液37℃灭活48 h,用稀释倍数为10-1、10-2、10-3的三种病毒液制备分别与1号佐剂、2号佐剂以及生理盐水制备出9组灭活疫苗。分别将制备的不同灭活疫苗以每尾0.2 mL腹腔注射接种健康鱼。将疫苗1组(病毒稀释度10-1与1号佐剂配苗组)接种健康斑鳢后,分别在15 d、25 d、35 d采集血清样品进行血清中和实验。结果显示:免疫15 d,血清中和效价为1:35,;免疫25 d血清中和效价为1:89,免疫35d,血清中和效价为1:98。表明25d和35d的血清免疫保护力显著高于15 d的。分别在免疫15 d、25 d、35 d后,以100 LD50浓度攻毒。结果,佐剂相同,病毒稀释倍数10-1制备的疫苗免疫保护率显著高于10-2、10-3的疫苗组;病毒浓度相同,2号佐剂配苗制备的疫苗免疫效果强于1号佐剂以及生理盐水的疫苗组;同一组疫苗,免疫后25 d和35 d攻毒的免疫效果强于15 d攻毒。表明用10-1病毒浓度与2号佐剂配苗制备的火活疫苗,在免疫25 d后能得到较高保护率。
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