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研究背景及目的白念珠菌是一种条件致病性真菌。近年来,由于广谱抗生素的大量不合理应用、激素的滥用、肿瘤的化学治疗及器官移植后免疫抑制剂的大量应用、免疫功能低下患者不断增多,使真菌感染发生率大大增加,其中白念珠菌感染最常见。氟康唑因其口服吸收效果好,生物利用度高,副作用小,通常作为临床首选治疗白念珠菌感染的药物,但随着氟康唑的大量、频繁使用,真菌耐药发生率逐年上升,导致临床治疗真菌感染的失败。本课题组前期药敏实验发现利福喷丁、舍曲林等联合氟康唑时对耐氟康唑白念珠菌可能有协同作用。利福喷丁为利福霉素类抗生素,是治疗结核病的一线用药,抗结核杆菌作用比利福平强,且药物不良反应比利福平小。到目前为止,关于利福喷丁体外抗真菌协同作用的研究较少,因此,我们开展利福喷丁联合氟康唑体外抗白念珠菌的效应研究,为临床治疗白念珠菌感染探索有效方法。实验方法第一部分:参考M27-A2方案中的微量液基稀释法测定利福喷丁、氟康唑单用及两药合用时对白念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）;用棋盘式测定利福喷丁联合氟康唑体外抗白念珠菌的效应。通过时间—生长曲线实验、Spot assay实验验证利福喷丁对氟康唑体外抗耐药白念珠菌的增效作用,并摸索后续实验研究所需的药物浓度。第二部分:应用透射电镜观察白念珠菌100分别在利福喷丁、氟康唑单药及两药联合作用前后超微结构的变化。第三部分:应用流式细胞仪检测白念珠菌100分别在利福喷丁、氟康唑单药及两药联合作用前后细胞周期的变化。实验结果第一部分:利福喷丁单药对实验所选12株白念珠菌均无抗菌活性(MIC80>1024μg/m L)。在氟康唑敏感白念珠菌株中,利福喷丁联合氟康唑后未表现出协同效应（FICI>0.5）;在氟康唑耐药白念珠菌中,利福喷丁联合氟康唑后均表现出显著的协同作用（FICI<0.1）,本试验所研究的菌株中,利福喷丁对氟康唑体外抗白念珠菌100的增效作用最好,故后续实验选用该菌株作为研究对象。生长曲线显示氟康唑耐药白念珠菌100在412h为生长对数期,之后进入生长的稳定期和衰退期。与生长对照组相比,单用药组对氟康唑耐药白念珠菌100生长无明显抑制作用,合药组显示出明显的抑制作用。利福喷丁（125ug/mL）与不同药物浓度的氟康唑（4、16、64ug/m L）联合应用时,对白念珠菌100的抑制作用不随着氟康唑剂量的增加而增强;不同药物浓度的利福喷丁（15.63、31.25、125ug/m L）与氟康唑（4ug/m L）合用时,利福喷丁浓度越高,对氟康唑耐药白念珠菌100的抑制作用越强。第二部分:透射电镜结果显示生长对照组的菌体形态规则,细胞结构完整、清晰,呈圆形或椭圆形,细胞壁光滑,胞膜结构连续,清晰可见,胞核及线粒体正常;利福喷丁组细胞形态基本正常,边界清楚,部分细胞见胞核肿胀不规则,未见明显空泡液泡;氟康唑组大多数细胞形态基本正常,部分细胞胞壁电子密度不均匀分布,透明层局灶性增厚,胞膜粗糙,可见肿胀的线粒体,核质相对分明,可见少量空泡、液泡;联合用药组大部分细胞形态不规则,细胞壁的电子透明层厚薄不一,细胞膜与细胞壁分离,层次不清,边界模糊,胞膜严重缺损,线粒体肿胀,核质界限不清,许多大小不等的团块状物质聚集于细胞膜附近,核膜断裂、溶解消失,胞核集聚不规则,凝聚成团。第三部分:通过流式细胞术检测药物作用12h、24h对耐氟康唑白念珠菌100细胞周期各期DNA含量变化。作用12h时,空白对照组、利福喷丁组、氟康唑组及合药组在G0/G1期细胞计数百分比分别为:（76.41±1.52）%、（75.48±1.41）%、（72.36±1.01）%、（8.11±0.22）%,S期细胞计数百分比分别为:（5.46±0.73）%、（8.46±0.23）%、（6.86±0.56）%、（12.52±0.54）%,G2/M期细胞计数百分比分别为:（18.14±1.11）%、（16.06±1.37）%、（20.78±1.48）%、（79.37±0.52）%;作用24h时,空白对照组、利福喷丁组、氟康唑组及合药组在G0/G1期细胞计数百分比分别为:（82.36±1.25）%、（70.52±3.11）%、（60.45±1.07）%、（8.11±0.22）%,S期细胞计数百分比分别为:（6.03±0.92）%、（12.15±1.92）%、（15.19±1.23）%、（7.79±1.45）%,G2/M期细胞计数百分比分别为:（11.61±0.86）%、（17.33±1.32）%、（24.36±0.40）%、（86.26±0.94）%,两药合用组比生长对照组及单用药组G0/G1期细胞数显著减少（p<0.01）,G2/M期细胞数显著增多（p<0.01）,表明联合用药组细胞周期阻滞在G2/M期,通过对12h、24h两个时间点对比发现,药物对白念珠菌100细胞周期的影响大体一致。结论利福喷丁单用时无抗白念珠菌活性,但利福喷丁能显著增强氟康唑抗耐氟康唑白念珠菌活性,说明利福喷丁对氟康唑体外抗耐药白念珠菌具有增效作用。通过透射电镜观察各组细胞超微结构推测,利福喷丁可能影响RNA或DNA的合成,也可能直接抑制真菌细胞膜上的某种酶的活性,从而发挥其对氟康唑体外抗耐药白念珠菌的增效作用。流式细胞仪检测发现两药合用时可将细胞周期阻滞在G2/M期,抑制真菌细胞的正常分裂增殖。本课题组首次发现利福喷丁对氟康唑体外抗氟康唑耐药白念珠菌具有增效作用,联合用药时抗真菌作用机制比较复杂,本阶段实验初步探索了利福喷丁对氟康唑体外抗耐药白念珠菌的增效作用机制,本课题组将在后续研究中通过检测胞膜甾醇含量、胞内药物含量及相关基因表达等实验进一步探索利福喷丁对氟康唑抗耐药白念珠菌增效作用机制,为耐药白念珠菌感染的临床治疗及新药研发提供新途径。