论文部分内容阅读
脑血管疾病是目前危害人类健康的三大疾病之一。其中70％-80％的脑血管病是缺血性脑血管疾病，以其高发病率、高死亡率严重危害着人们的健康。然而，目前疗效卓著的抗脑缺血药物仍十分稀少。因此，寻找和研究有效的抗脑缺血药物(尤其是从中草药中)有着重大的社会和经济意义。
脑缺血的治疗方法主要有溶栓和神经保护，在神经保护为指导思想的方法治疗急性神经损伤进展缓慢的情况下，保护神经血管单元(neurovascular unit，NVU)，包括血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的完整性，可能是今后脑缺血后神经系统康复药物的研究重点。
蛇床子素(Osthole，Ost)是一种主要从伞形科蛇床属植物蛇床的果实中提取出来的香豆素类成分。现代药理研究表明，Ost在心血管系统、中枢神经系统(central nervoussystem,CNS)、免疫系统都有广泛的作用。主要的机制包括抗炎和抗氧化。提示Ost可能具有抗脑缺血损伤的作用。研究目的
研究Ost对实验性脑缺血再灌注损伤的保护作用并揭示其可能的机制，为Ost防治缺血性脑血管疾病提供实验依据。研究方法
1.采用雄性C57 BL/6J小鼠双侧颈总动脉夹闭(bilateral common carotid arteryocclusion/two-vessel occlusion,BCCAO/2VO)25 min再灌注制作全脑缺血模型，水迷宫实验中小鼠随机分为6组(假手术组，模型组，模型+Ost100 mg/kg，模型+Ost50mg/kg，模型+Ost25 mg/kg，模型+阳性药物组)，其他实验分为3组(假手术组，模型组，模型+Ost100 mg/kg)。不同实验组分别在缺血前30min及再灌后立即i.p.给予溶剂(假手术组，模型组)或药物(模型+Ost100 mg/kg，模型+Ost50 mg/kg，模型+Ost25 mg/kg，模型+阳性药物组)，并进行以下2-6项实验。
2.利用Morris水迷宫检测学习记忆功能。
3.苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin,HE)染色观察脑病理学变化。
4.伊文思蓝(Evans blue，EB)法分析BBB通透性。
5.检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，观察Ost对氧化应激的影响。
6.RT-PCR检测基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的mRNA水平。
7.采用雄性SD大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)2 h再灌24 h制作局灶性脑缺血模型，大鼠随机分为3组(假手术组，模型组，模型+Ost100mg/kg)。不同实验组分别在缺血前30min及再灌后立即i.p.给予溶剂(假手术组，模型组)或Ost(模型+Ost100 mg/kg)，并进行以下8-11项实验。
8.Longa法神经功能评分检测神经损伤程度。
9.2,3,5-氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazoliu chloride，TTC)染色检测脑梗死体积。
10.明胶酶谱法检测MMP-9活性。
11.免疫印记法(Western blotting)检测MMP-9蛋白质水平。研究结果
1.Morris水迷宫结果显示，Ost三个剂量组(100 mg/kg，50 mg/kg，25 mg/kg)可以显著缩短缺血再灌注4 d后模型小鼠的逃避潜伏期，延长探索实验中目标象限的游泳时间，特别是在给予100 mg/kg药物的小鼠上作用最为明显。
2.缺血再灌注8 d后进行组织病理染色，结果显示，Ost可以改善模型组小鼠出现的病理改变，包括神经元数目减少，胶质细胞增生，排列紊乱，死亡细胞结构不清，轮廓模糊，胞浆呈空泡样变，核固缩，胞质嗜伊红浓染，特别是海马CA1区域。
3.BBB通透性实验中，模型+Ost100 mg/kg组和模型组相比在再灌后4 h和24 h两个时间点均明显减少了EB的渗漏，其中4 h组减少了34.3％，24 h组减少了20.9％。
4.SOD活性和MDA含量测定结果显示，再灌后24 h，模型+Ost100 mg/kg组和模型组相比能够使SOD活性升高63.6％，升高有显著性差异(P＜0.05)。同时，Ost(100mg/kg)也可以减少MDA含量13.08％，和模型组相比同样具有显著性差异(P＜0.05)。
5.RT-PCR结果显示，和假手术组相比，24 h模型组mRNA表达显著升高(1.70-fold，P＜0.01)。4 h模型组表达也略有升高，但无显著性差异。Ost(100 mg/kg)可以明显抑制4 h和24 h两个时间点MMP-9的mRNA表达升高(P＜0.01)。
6.Ost(100 mg/kg)可以显著降低脑缺血再灌注24 h后大鼠神经功能评分(P＜0.01)，减轻大鼠的脑缺血再灌注损伤的程度。
7.再灌注24 h后，与模型组相比，Ost(100mg/kg)能够显著减少平均脑梗死体积(P＜0.01)，减少的体积占到了模型组梗死体积的33.8％。
8.明胶酶谱结果显示，Ost(100 mg/kg)可以显著性地抑制缺血再灌注24 h后模型大鼠海马中MMP-9活性的升高(P＜0.05)。
9.Western blotting结果显示，Ost(100 mg/kg)可以显著性地抑制缺血再灌注24 h后模型大鼠海马中MMP-9蛋白含量的升高(P＜0.05)。总结和展望
本实验分别在小鼠全脑缺血模型和大鼠局灶性脑缺血模型上进行了Ost的作用和机制研究。实验结果表明，Ost对两种模型均有明显的神经保护作用，这种作用可能是通过Ost的抗氧化作用，下调MMP-9通路，从而保护BBB来实现的。仍有研究需要进一步开展，包括更深层的机制和给药时间窗等方面的问题。