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研究背景慢性粒细胞白血病（chronicmyeloidleukemia，CML）是一种起源于造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病，为严重危害人类健康的造血系统恶性肿瘤。其特异性的费城（Ph）染色体在分子水平上刺激白细胞源源不断的分裂增殖，是CML的主要发病机制。靶向治疗药物伊马替尼（imatinib，IM）在细胞水平抑制Ph染色体阳性的白血病细胞，是慢性粒细胞白血病治疗方法中新的里程碑。随着IM在临床上广泛应用，不敏感以及耐药的现象逐渐突显出来，严重影响了药物疗效，限制了IM的用药适应症。虽然CML疾病进程相对缓慢，但缺乏有效的治疗使其远期生存率不理想，对于CML终末期-急变期患者，至今缺乏规范、有效的治疗手段。由于缺乏合适的供体以及对IM耐药，即使是提高其剂量，增加副作用的同时也只能延长患者的生存期，并不能最终治愈。因此，对于CML急变期患者积极寻找新的治疗方法尤为重要，逆转IM耐药问题逐渐成为研究热点。硼替佐米（Bortezomib，Bor）是第1个获准临床上市的蛋白酶体抑制剂，是一种新型的抗肿瘤药物，具有高选择性及可逆性，主要通过抑制真核生物26S蛋白酶体对蛋白质的降解，不但可以增加肿瘤细胞的凋亡，还可以增加肿瘤细胞对化疗的敏感性[1、2]，国内外学者已发现在联合其他化疗药物作用后，Bor可增强其他化疗药物的作用效果，有效治疗多种白血病。本实验以IM耐药的慢性粒细胞白血病急变期患者骨髓原代细胞为研究对象，分别给予IM单药或联合Bor作用，检测耐药指标BCR-ABL、P-gp、COX-2mRNA，以及凋亡指标AnnexinV-EGFP／PI、XIAPmRNA的变化，从而研究Bor对慢性粒细胞白血病急变期细胞的作用及其机制，为扩展Bor在临床上治疗CML提供实验依据。实验方法1.四甲基偶氮唑蓝法检测药物单独及联合应用对原代细胞的生长抑制作用；2.流式细胞术检测细胞的凋亡率、细胞周期、P-gp；3.实时荧光定量PCR检测BCR/ABL以及COX-2、XIAP基因mRNA表达变化。实验结果1.MTT结果：不同浓度的IM及Bor作用不同时间后均对原代细胞有抑制作用。同一实验组随时间的延长抑制率增加，差异具有统计学意义（P均<0.05）；同一时间点不同浓度间比较，随药物浓度增加抑制率升高，差异具有统计学意义（P均<0.05）；两药联合后的抑制作用均较两单药组明显（P均<0.05）。2.AnnexinV-EGFP／PI检测结果：经48h培养后，除对照组凋亡不明显，其余各实验组均可见到细胞凋亡现象，随着各单药组浓度的增加，细胞凋亡率也逐渐增加（P均<0.05），联合用药组凋亡率较各单药组比较有统计学差异（P均<0.05）。3.流式细胞术检测细胞周期结果：各组细胞均存在不同程度G2/M期升高现象，联合用药组较IM单药组G2/M期显著升高（P均<0.05）。4.P-gp检测检测结果：各标本IM单药组P-gp表达量不尽相同，总体没有显著性差异（P>0.05）；Bor单药组作用后P-gp表达量不同程度下降，差异有统计学意义（P<0.05）；联合用药组对比IM单药组P-gp表达量显著下降（P均<0.05）。5.qRT-PCR检测结果：各组标本空白对照组BCR-ABL、COX-2mRNA及XIAPmRNA表达均阳性；联合Bor作用48h后，BCR-ABL基因mRNA水平与其ABL的比值下降（P<0.05）；COX-2及XIAPmRNA水平表达明显受抑（P<0.05）。实验结论1.Bor在体外对IM耐药的CML急变期原代细胞有抑制作用，且呈时间-剂量依赖。2.IM联合非细胞毒性剂量的Bor后，对细胞的抑制作用明显增强，说明Bor对IM耐药的CML急变期原代细胞有增敏作用。3.Bor使细胞G2/M期阻滞，从而进入细胞增殖周期，提高细胞对药物的敏感性。4.Bor可能通过减少细胞表面P-gp表达，降低BCR-ABL、COX-2及XIAP基因转录从而增加细胞凋亡，逆转细胞耐药。